首页 > 文献资料
-
骨形态发生蛋白2、6在肝癌中的表达及意义
目的:研究骨形态发生蛋白2、6(BMP-2、6)在肝癌组织中的表达,并探讨其与肝癌生物学行为的关系.方法:应用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和Western blot检测30例正常肝脏组织和30例肝癌组织的BMP-2、6的表达水平.结果:正常肝脏组织BMP-2、6 mRNA相对表达量显著低于肝癌组织(0.3245±0.1127vs 0.8298±0.1187,0.2947±0.1853 vs 0.7145±0.1373,均P<0.05),Ⅲ、Ⅳ期肝癌组织BMP-2、6 mRNA相对表达量显著高于Ⅰ、Ⅱ期(0.92431±0.1234 vs 0.69355±0.1925,0.8354±0.1423 vs 0.6043±0.1234,均P<0.05).We s t e r n b l o t检测有远处转移的肝癌组织BMP-2、6表达高于无远处转移的肝癌组织(0.9854±0.2888 vs 0.6244±0.3087,0.9076±0.1276 vs 0.5678±0.2493,均P<0.01).结论:BMP-2、6在肝癌中表达上调,可能在肝癌的发生发展中起着重要的作用,其表达上调可能促进肝癌的浸润和转移.
关键词： 癌 肝细胞 骨形态发生蛋白 逆转录-聚合酶链反应 蛋白质印迹 -
PBC患者granulysin基因和蛋白的表达及临床意义
目的:探讨颗粒溶素(granulysin,GNLY)在原发性胆汁性肝硬化和患者(PBC)中的表达及其意义.方法:采用TaqMan探针技术,以18S rRNA为内参照,测定60例PBC患者外周血中GNLYmRNA的含量,同时应用酶联免疫吸附法(ELISA),检测PBC患者血清中GNLY蛋白的水平,并以健康体检组(n=100)和乙型肝炎肝硬化组(n=60)为对照.结果:PBC组GNLY mRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组[(2.7±2.5)×108 vs (3.0±1.9)×107,P＜0.01]和乙型肝炎后肝硬化组[(2.7±2.5)×108 vs (4.7±3.6)×105,P＜0.001).PBC患者血清中的GNLY蛋白表达显著高于健康对照组(15.48±3.24 μg/L vs 4.76±2.32 μg/L,P＜0.01)和乙型肝炎后肝硬化组(1 5.48±3.24 μg/L vs 2.57±1.84 μg/L,P＜0.01).结论:GNLY的表达与PBC的发生、发展存在一定的相关性,可用于PBC临床诊断.
关键词： 原发性胆汁性肝硬化 颗粒溶素 逆转录-聚合酶链反应 酶联免疫吸附测定法 -
转基因细胞模型L02/HBx的构建及HBx对细胞周期的影响
目的:构建L02/HBx转基因细胞模型并研究HBx对肝细胞周期的影响.方法:运用脂质体转染和G418筛选获得L02/HBx阳性克隆,并分别用RT-PCR和Westernblot鉴定HBx mRNA与蛋白的表达.进一步用四唑蓝(MTT)比色试验、流式细胞仪检测L02/HBx的增殖、凋亡和细胞周期.结果:RT-PCR和Western blot分别检测到L02/HBx细胞中HBx mRNA和蛋白的表达.MTT比色试验显示L02/HBx生长速度加快,流式细胞仪检测发现L02/HBx凋亡率低(0.09%±0.13%vs 3.74%±1.29%,P＜0.05),G1期细胞比例减少(61.35%±0.82% vs 67.80±6.84%,P＜0.05),S期细胞比例相应增加(36.59%±2.54% vs 22.37%±2.17%,P＜0.05).经阿霉素(ADM)培养后,L02/HBx的凋亡率显著增加(34.91%±5.85% vs 0.09%±0.13%,P＜0.05),G1期细胞比例明显增加但低于对照组(82.81%±6.48%vs 61.35%±0.82%,P＜0.05;82.81%±6.48%vs 87.19%±1.92%,P＜0.05),S期细胞比例降低但较对照组高(13.84%±6.16% vs 36.59%±2.54%,P＜0.05;13.84%±6.16% vs 2.22%±1.26%,P＜0.05).结论:L02/HBx构建成功,HBx能促进细胞周期进程,加快细胞的生长并抑制细胞的凋亡;转染HBx基因的肝细胞凋亡更易受凋亡因子所触发,表明HBx可能会增加正常肝细胞对诱导凋亡因素的敏感性.
-
人内皮抑素endostatin基因的融合表达纯化及活性测定
目的:获得有活性的人内皮抑素(endostatin)融合蛋白.方法:从人胎肝组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出endostatin基因,定向克隆重组入pTRX表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,纯化,MTT法测定endostatin蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞的抑制活性.结果:RT-PCR获得endostatin基因,扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶上显示为1条扩增条带,约573 bp,与预计大小一致.将PCR产物连入PGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆经KpnI,NotI酶切鉴定、测序验证.构建pTRX-endo表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,大小与预期相符合.重组蛋白经纯化,MTT法测定重组人内皮抑素蛋白具有生物学活性.人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)受到明显抑制,具有剂量依赖抑制关系,ED50=550μg/L.结论:人内皮抑素基因在原核细胞表达载体pTRX中获得成功表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖.
关键词： 人内皮抑素基因 融合表达 活性 逆转录-聚合酶链反应 MTT法 -
大鼠肝卵圆细胞增殖模型肝脏的GJIC功能和意义
目的:研究大鼠肝卵圆细胞(HOC)增殖模型肝脏缝隙连接蛋白32,43(CX)的表达及缝隙连接细胞间通讯(GJIC)的功能,探讨HOC增殖的可能机制.方法:健康♂Wistar大鼠,随机分成正常对照组(n=6),模型组.模型组大鼠按每天20 mg/kg剂量灌喂2-AFF,连续4 d,第5天不灌喂行2/3肝切除,术后次日按每天20 mg/kg剂量继续灌喂5 d(2-AFF/PH).模型组在术后4 h,4,8,12和16 d随机取6只大鼠检测.采用组织病理技术观察肝组织的形态学变化;免疫组化和细胞形态学方法计数HOC;切开标记/染料示踪技术(incision loading/dye transfer, IL/DT)技术确定GJIC;免疫组化及RT-PCR技术检测CX32蛋白及mRNA表达;免疫组化、Western blot及RT-PCR技术分析CX43蛋白及mRNA水平.结果:对照组及模型组4 h未见HOC增殖.模型组4 d汇管区有HOC增殖反应,8 d HOC增殖达峰值,12 d HOC从汇管区向肝实质内浸润,16 d HOC增殖减少较12 d减少;IL/DT检测结果显示,模型组各时点(4 h,4,8,12和16 d)染料扩散距离低于对照组(84.5±3.4,60.6±3.3,108.6±4.2,150.6±2.6,199.6±3.7 μm vs 250.0±5.0 μm,P＜0.01),GJIC功能降低.模型组各时点CX32表达均低于对照组(P＜0.05),在4 h下调,4 d达低峰(2.85±0.39),8 d后逐渐恢复;RT-PCR显示模型组CX32 mRNA在4 h开始下降,4 d达低峰(0.33±0.11),8 d后逐渐恢复,16 d高于对照组,但无显著差异(P＞0.05).Western blot结果显示模型组CX43蛋白表达在4 h上调(P＞0.05)、4-16 d明显升高;RT-PCR显示模型组4 h CX43 mRNA上调(P＞0.05),4 d表达明显升高,12 d达高峰(5.46±0.58),16 d低于对照组,但无显著差异(P＞0.05).结论:采用Solt-Farber方法成功建立了HOC增殖动物模型;大鼠2-AAF/PH肝脏CX表达呈时空特异性变化,使肝脏GJIC功能抑制.肝脏的GJIC抑制可能启动了HOC增殖.
-
靶向CTGF锤头核酶对TGF-β1作用下人肝星状细胞合成Ⅰ型胶原的作用
目的:探讨靶向结缔组织生长因子(CTGF)的锤头核酶抑制TGF-β1作用下人肝星状细胞(HSC)Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)合成及其细胞周期进程的作用.方法:构建含有人CTGF锤头核酶cDNA序列的重组质粒pTriCTGF-Rz.将空质粒pTriEx2和重组质粒pTriCTGF-Rz分别转染人肝星状细胞系(LX-2)细胞.细胞分为4组:pTriEx2转染组,pTriEx2转染加TGF-β1组,pTriCTGF-R2转染加TGF-β1组和pTriCTGF-Rz转染组.采用半定量RT-PCR测定LX-2细胞CTGF mRNA和Col Ⅰ mRNA转录水平,采用ELISA和流式细胞仪分别用于LX-2细胞Col Ⅰ分泌功能和LX-2细胞周期进程的检测.结果:TGF-β1可明显提高LX-2细胞CTGFmRNA和Col Ⅰ mRNA的转录水平及分泌Col Ⅰ蛋白功能(t=11.14,14.36,7.17,均P＜0.01);pTriCTGF-Rz转染LX-2细胞既能降低基础CTGF mRNA和Col Ⅰ mRNA水平及Col Ⅰ蛋白水平(t=2.86,3.06,2.97,均P＜0.05),又能部分拮抗TGF-β1诱导LX-2细胞CTGF mRNA和Col Ⅰ mRNA转录和Col Ⅰ蛋白分泌的增加(t=2.99,3.09,3.02,均P＜0.05).TGF-β1对LX-2细胞周期进程无影响.结论:CTGF是TGF-β1作用下人肝星状细胞合成Col Ⅰ的下游介导者,TGF-β1对HSC周期进程无影响,靶向CTGF有可能成为肝纤维化基因治疗的新靶点.
-
结肠癌耐药细胞株LoVo/5-FU的建立及其差异表达基因的筛选
目的:建立结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU并初步筛选可能的耐药相关基因.方法:采用5-FU浓度递增法建立人结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU,观察其生长规律并绘制细胞生长曲线;用MTT法鉴定耐药细胞株耐药性并计算耐药指数(RI);用基因芯片技术检测耐药细胞株LoVo/5-FU与其亲本细胞株LoVo中的差异表达基因,从中筛选出可能的耐药相关基因;用半定量RT-PCR方法对筛选出的部分耐药相关基因在耐药细胞及其亲本细胞中的表达情况进行验证.结果:LoVo/5-FU细胞与LoVo细胞相比,生长缓慢,细胞体积增大.LoVo/5-FU对5-FU、ADM、MMC耐药,而对CDDP无耐药性(RI:7.69,2.78,1.43和0.96).通过基因芯片筛选出差异表达基因425个,可能的耐药相关基因包括CYP1B1,NAT2,RNF20,SNAI2,MAP3K2,其中CYP1B1在LoVo/5-FU与LoVo中的表达有明显差异(Cv5/Cy3=5.877).结论:LoVo/5-FU细胞株耐药性稳定,耐药机制可能与CYP1B1,NAT2等耐药相关基因有关.
-
趋化性细胞因子受体CXCR4基因沉默对大肠癌细胞体外侵袭及增殖能力的影响
目的:研究趋化性细胞因子受体CXCR4短干扰RNA(siRNA)对大肠癌细胞系体外侵袭及增殖能力的影响.方法:利用T7 RNA聚合酶体外合成以CXCR4为靶基因的siRNA,用脂质体转染大肠癌SW480细胞,同时设立空白对照组和无关对照组.于转染后48 h采用RT-PCR方法检测CXCR4 mRNA水平,免疫印迹方法检测CXCR4和MT1-MMP的蛋白质水平,Bovden小室模型检测体外侵袭能力的变化,流式细胞术检测细胞周期的分布情况,MTT法测定细胞增殖状况.结果:SW480细胞转染CXCR4 siRNA 48 h后,与空白对照和无关对照相比,CXCR4mRNA水平明显下调(51.53%±6.1% vs 78.4%±3.3%,P＜0.01;51.53%±6.1% vs 87.4%±5.3%,P＜0.01),CXCR4的蛋白质水平明显降低(47.3%±3.7% vs 107.2%±3.6%,P＜0.01;47.3%±3.7% vs 114.7%±4.8%,P＜0.01),MT1-MMP蛋白表达水平也明显下降(43.8%±2.5% vs 64.4%±4.4%,P＜0.01;43.8%±2.5% vs 67.0%±2.9%,P＜0.01),细胞的体外侵袭能力减弱(26.5%±6.1% vs 73.7%±3.4%,P＜0.01;26.5%±6.1% vs 64.5%±5.7%,P＜0.01),细胞周期的分布无明显差异.在无SDF-1存在的情况下,各组细胞的增殖无明显改变;经SDF-1刺激后,各组细胞增殖增加,但CXCR4 siRNA转染组细胞的增殖显著低于空白对照组和无关对照组(24 h:0.55±0.03 vs 0.68±0.06,0.71±0.04,P＜0.05;48 h:0.67±0.04 vs 0.89±0.03,0.94±0.07,P＜0.05;72 h:0.72±0.06 vs 1.36±0.08,1.53±0.07,P＜0.01).以上各指标在空白对照和无关对照之间无显著性差异(P＞0.05).结论:以CXCR4为靶向的siRNA能够有效下调CXCR4基因,降低SDF-1诱导的大肠癌细胞系体外侵袭能力及增殖活性.
-
含Apoptin基因重组腺病毒的构建及鉴定
目的:构建携凋亡素(Apoptin)基因重组腺病毒,为进一步研究Apoptin基因抗肿瘤作用分子机制建立基础.方法:利用BamH Ⅰ和Spe Ⅰ双酶切质粒pVAXl Apoptin,获得Apoptin片段并连接入pacAd5 CMV K-N pA,构建含Apoptin基因的穿梭质粒pacAd5-Apoptin.利用尸盘Pac Ⅰ单酶切对pacAd5-Apoptin和腺病毒基因组质粒(pAd5)进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞,分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Westem blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定,并测定所获得重组病毒的滴度.结果:所构建重组腺病毒中的Apoptin基因得到了正确转录,表达产物的相对分子质量约为13 kDa,与CVA阳性对照一致;所获得重组腺病毒可有效表达Apoptin蛋白,该蛋白与CAV阳性血清具有反应原性,重组病毒滴度为1011PFU/L.结论:成功构建含Apoptin基因的重组腺病毒,所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求.
关键词： Apoptin基因 腺病毒载体 基因治疗 逆转录-聚合酶链反应 免疫印迹法 -
TNF-α对胃癌细胞MMP-2和MMP-9表达的诱导作用
目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对胃癌细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的诱导作用.方法:以外源性TNF-α作用于胃癌细胞.未经TNF-α作用的胃癌细胞作为对照.采用ELISA法检测胃癌细胞培养上清液中MMP-2和MMP-9蛋白的含量.采用RT-PCR检测胃癌细胞MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表达状况.采用Western blot检测胃癌细胞内MMP-2蛋白和MMP-9蛋白含量.结果:不同浓度(1,10和100 μg/L)的TNF-α作用胃癌细胞后,胃癌细胞上清液中MMP-2的含量分别为8.24±1.36,23.65±3.45和14.83±2.54 ng/L,均显著高于对照组(1.56±0.23 ng/L,P＜0.01);MMP-9的含量分别为12.47±2.66,34.12±6.78和23.31±4.45 ng/L,亦均明显高于对照组(5.25±0.89 ng/L,P＜0.01),其中以10μg/L TNF-α作用时升高为显著.TNF-α作用胃癌细胞16 h后,上清液中MMP-2和MMP-9含量达到峰值,分别为23.65±3.45和34.12±6.78 ng/L.胃癌细胞MMP-2 mRNA和MMP-9mRNA表达明显增强,胃癌细胞内MMP-2和MMP-9蛋白表达亦明显增多.结论:TNF-α可上调胃癌细胞MMP-2和MMP-9表达.
-
瘦素对脂变人肝细胞TG的含量及PPARα、CPT-I表达的影响
目的:探讨瘦素对肝细胞脂质变性的作用及其机制.方法:以离体人肝L-02细胞株制备肝细胞脂肪变性模型.实验分为正常肝细胞组、人肝L-02细胞脂肪变性模型组、瘦素不同浓度处理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(浓度分别为10-8、10-7、10-6mol/L)和阳性对照组.孵育24 h后,油红O染色观察细胞形态和细胞内脂滴的形成,高效液相色谱法(HPLC)检测细胞内甘油三酯(TG)的含量.RT-PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)及其目标基因肉碱转移酶-I(CPT-D) mRNA水平的表达.结果:模型组和瘦素I组细胞质中有较多的脂滴形成,而瘦素Ⅱ、Ⅲ组、正常组、阳性对照组胞质中脂滴较少.瘦素浓度为10-8、10-7、10-6mol/L时,肝细胞中TG的含量为1.063±0.146、0.648±0.023、0.553±0.045 mmoL/g蛋白,呈细胞依赖性减少.瘦素Ⅱ、Ⅲ组与阳性对照组比较.PPARα仅的mRNA表达上升更为明显,差别有统计学意义(p<0.01);但瘦素I组与阳性对照组之间无显著性差异.模型组与正常组比较,CPT-I mRNA表达无明显改变,经瘦素处理后,较模型组相比,CPT-I mRNA表达明显上升(p<0.01).结论:瘦素能降低人肝L-02脂变细胞内TG的含量,呈剂量依赖关系,其降低细胞内TG作用可能与PPARα及其目标基因表达上调有关.
-
COL1A1-shRNA表达质粒构建及抑制COL1A1表达的有效序列的筛选
目的: 构建和筛选对大鼠肝星状细胞前Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)mRNA有抑制作用的COL1A1短发夹RNA (shRNA)的表达质粒.方法:从NCBI网站获得大鼠的COL1A1 cDNA序列, 根据Whitehead研究所的siRNA设计软件设计3条理论上佳的siRNA序列, 相应的双链DNA被插入pGPU6/GFP/Neo质粒中, 即pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C. 为得到高效沉默COL1A1-siRNA, 以脂质体LipofectAMINE2000, 将1、2、3、4 μg DNA质粒转染至HSC-T6细胞中, 并观察转染效果. 将佳沉默siRNA导入HSC-T6细胞, RT-PCR分析各组的COL1A1 mRNA表达水平.结果: 靶向COL1A1 mRNA的3个shRNA重组质粒载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C经测序分析, shRNA编码序列与设计的片段完全一致, 经酶切凝胶电泳证实载体构建成功. 1、2、3、4 μg组转染效率分别为16.7%、20.3%、23.5%和22.3%, 以2 μg siRNA为佳剂量, pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C对COL1A1 mRNA的抑制率分别为16.6%, 63.3%和80.3%. 结论:筛选出的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C表达质粒能高效地抑制转染细胞COL1A1 mRNA的表达, 从而为肝纤维治疗提供新的方法和材料.
关键词： 前Ⅰ型胶原α1链 肝星状细胞 RNA干扰 质粒 逆转录-聚合酶链反应 -
二氮杂菲对三硝基苯磺酸所致大鼠结肠炎的治疗作用
目的:研究MMP抑制剂二氮杂菲防治三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)肠炎的作用.方法:TNBS建立慢性结肠炎大鼠模型,并将其分为3组: 治疗组给药1,10-二氮杂菲;对照组给SASP;空白对照组给予双蒸水1 mL.7d后,处死大鼠,测定中性粒细胞髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性;RT-PCR检测肠道组织MMP-1,MMP-2,MMP-3和TIMP-1 mRNA的表达;免疫组织化学方法检测MMP-3和TIMP-1蛋白质的表达.结果:SASP组和二氮杂菲组MPO的A值明显低于对照组(0.25±0.15,0.16±0.09 vs 0.48±0.34,P=0.025,0.004),MMP-1,MMP-2及MMP-3表达在SASP组(0.19±0.11,0.35±0.21,0.25±0.16)和二氮杂菲组(0.33±0.19,0.29±0.16,0.22±0.17)无明显差异,与对照组(0.45±0.23,0.53±0.17,0.62±0.15)相比明显偏低(P=0.002,0.020,0.000).3组之间TIMP-1mRAN及蛋白表达均无差异.MMP-3在SASP组和二氮杂菲组的蛋白表达量均较对照组低(2971.3±1036.5,2507.7±1101.0 vs 7812.8±4761.6,P=0.000).结论:二氮杂菲治疗大鼠TNBS肠炎后,肠道损伤积分、MPO以及MMP-1,MMP-2和MMP-3的mRNA的表达均明显下降,但不影响TIMP-1的表达.
-
牛磺酸对大鼠胰岛活性和功能的保护作用
目的:探讨牛磺酸(taurine,Tau)在大鼠胰岛培养过程中对胰岛的保护作用及其机制.方法:实验Wistar大鼠分为2组,RPMI 1640组和牛磺酸组(Tau组).流式细胞仪检测Caspase-9和磷酸化Akt阳性细胞比例,观察牛磺酸对Caspase-9及Akt的影响.RT-PCR检测单纯1640组和Tau组胰岛细胞的TNF-α、IL-1β、NF-κB和HO-1基因的表达.结果:胰岛单纯用RPMI 1640培养1 wk后激活的Caspase-9与加入牛磺酸后相比有统计学意义(41.03%±4.46% vs 23.85%±3.09%,P<0.05).胰岛分离纯化后有明显的TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、NF-κB mRNA、HO-1mRNA表达,随着培养时间的延长TNF-αmRNA、IL-1β mRNA、NF-κB mRNA表达逐渐减弱,HO-1 mRNA表达逐渐增强.加入牛磺酸后胰岛TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、NF-κB mRNA表达明显减弱,在6 h,72 h及1 wk时(TNF-α:0.34±0.02.0.24±0.01,0.19±0.02;IL-1β:0.24±0.09,0.09±0.01,0.05±0.01;NF-κB:1.76±0.30,0.93±0.15,0.37±0.02)和单纯培养组(TNF-α:0.57±0.1,0.39±0.02,0.29±0.02;IL-1β:0.34±0.02,0.24±0.01,0.19±0.02;NF-κB:2.52±0.24.1.21±0.14,0.76±0.07)比较差异具有显著性(均P<0.05).HO-1mRNA的表达较单纯培养组明显增强且随着时间的延长表达更明显(3.74±0.10,4.33±0.29.5.28±0.29 vs 2.46±0.30,3.13±0.07,3.59±0.22;均P<0.05).结论:牛磺酸能抑制TNF-α、IL-1β和NF-κB转录并活化Akt,抑制细胞凋亡.
-
反义RNA对胃癌细胞MT1-MMP基因表达和侵袭性的抑制作用
目的:膜研究膜型-1基质金属蛋白酶(MT1-MMP)反义RNA对人胃癌细胞BGC823靶基因表达和侵袭特性的影响.方法:利用基因重组技术构建人MT1-MMP反义RNA真核表达载体,转染人胃癌细胞BGC823,应用RT-PCR、MTT、明胶酶谱和体外侵袭实验等方法观察人胃癌细胞BGC823转染前后,MT1-MMP mRNA表达水平、细胞生长、明教酶A活性及细胞体外侵袭能力等指标的变化.结果:成功构建了MT1-MMP反义RNA真核表达载体pasMMP14,将其转染胃癌细胞BGC823后,与阴性对照组相比,实验组MT1-MMP mRNA表达水平降低,抑制率为36%.转染48 h,明教酶A的活化受到了明显抑制.转染72 h,细胞增殖明显受抑(t=2.358,P＜0.01 vs 空白组;t=2.727P＜0.01 vs 阴性组).实验组的穿膜细胞数明显低于空白对照组和阴性对照组(t=5.744,P＜0.01;t=5.695,P＜0.01).结论:反义RNA对人胃癌细胞MT1-MMP基因表达和侵袭能力具有明显的抑制作用,MT1-MMP基因可作为胃癌抗侵袭治疗的分子靶点.
-
肝脏GJIC对大鼠体内肝卵圆细胞增殖的影响
目的:研究肝脏缝隙连接细胞间通讯(GJIC)对大鼠体内肝卵圆细胞(HOC)增殖的影响.方法:健康♂Wistar大鼠,随机分成对照组(n=6)、模型组、苯巴比妥(Phenobarbital,PB)组.模型组大鼠按每天20 mg/kg剂量灌喂2-AFF,连续4 d,第5天不灌喂行2/3肝切除,术后次日按每天20 mg/kg剂量继续灌喂5 d(2-AFF/PH);PB组予以0.8 g/L PB饮水7 d,第8天按模型组处理,0.8 g/L PB饮水持续至实验结束.模型组、PB组在术后4 h,4,8,12和16 d随机取6只大鼠检测.采用组织病理技术观察肝组织的形态学变化;免疫组化和细胞形态学方法计数HOC;切开标记/染料示踪技术(incision loading/dye transfer,IL/DT)技术确定GJIC;免疫组化及RT-PCR技术检测CX32蛋白及mRNA表达;免疫组化、Western blot及RT-PCR技术分析CX43蛋白及mRNA水平.结果:对照组及模型组和PB组4 h未见HOC增殖.模型组4 d汇管区有HOC增殖反应,8 d HOC增殖达峰值,12 d HOC从汇管区向肝实质内浸润,16 d HOC增殖较12 d减少.与模型组比较PB组4-16 d各时点HOC明显增加(P＜0.01);IL/DT显示各时点模型组大鼠肝脏GJIC均低于对照组(P＜0.01),与模型组比较PB组各时点GJIC进一步降低(P＜0.01);模型组、PB组各时点CX32的表达低于对照组(P＜0.05),与模型组比较PB组CX32表达在4 h,12,16 d时点减少(P＜0.05),在4,8 d时点表达增多(P＜0.05);模型组4 h-16 d时点CX32 mRNA水平分别为对照组的0.82±0.13,0.33±0.11,0.51±0.13,0.68±0.14,1.12±0.18倍,与模型组比较PB组4 h时点无显著差异(P＞0.05),4-16 d时点明显升高(P＜0.05).模型组4 h-16 d各时点CX43蛋白表达分别为对照组的1.14±0.17,3.87±0.35,5.28±0.48,2.96±0.33,2.12±0.19倍,与模型组比较PB组CX43蛋白4 h上调(P＞0.05),4-16 d明显减少(P＜0.05).模型组4 h-16 d各时点CX43 mRNA水平分别为对照组的1.09±0.16,2.82±0.23,5.46±0.58,3.34±0.64,0.91±0.11倍.与模型组比较PB组各时点CX43 mRNA表达上调(P＜0.05).结论:改变大鼠2-AAF/PH模型肝脏CX32、CX43的时空表达模式,降低肝脏肝细胞及HOC与其偶联细胞的GJIC,可解除HOC生长抑制,促进HOC的增殖.
-
脂肪变性对肝细胞胆固醇代谢的影响
目的:探讨非酒精性脂肪性肝病中肝细胞胆固醇(TC)代谢的相关变化.方法:正常成人肝细胞株HL-02,以油酸软脂酸诱导肝细胞产生脂肪变性,建立肝细胞脂肪变性模型.分别于实验12、24、48 h收集细胞,同期设不含脂肪酸培养的细胞作对照.油红O染色观察细胞内脂滴变化;试剂盒检测细胞内三酯酰甘油(TG)和TC含量的变化情况.RT-PCR分别检测表达固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2),其靶基因羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)、低密度脂蛋白受体(LDLR)及TC 7α羟化酶(CYP7αl)的基因mRNA变化. 结果:油酸软脂酸诱导12 h即可产生肝细胞脂肪变性,24h及48 h脂肪变性逐渐加重.随造模时间延长,模型组细胞内TG、TC含量逐渐增多,且均显著高于对照组(TG:16.93±1.57 mg/g,23.67±2.4 mg/g,51.1±11.76 mg/g vs 8.43±5.65 mg/g;TC:14.9±0.6,23.7±1.1 mg/g,38.4±4.5 mg/g vs 8.5±1.6 mg/g;均P<0.01);SREBP-2,HMGCR mRNA表达逐渐升高(SREBP-2 mRNA:1.2972±0.16,1.6141±0.21,2.0368±0.27 vs 1.0±0.11:HMGCR mRNA: 1.0311±0.15,1.2706±0.28, 1.3954±0.32 vs1.0±0.12:均P<0.05),而LDLR、CYP7α1 mRNAA表达逐渐下降(LDLR mRNA:0.8901± 0.22.0.7846±0.18,0.6912±0.09 vs 1.0±0.24; CYP7α1 mRNA:0.9726±0.27,0.6707±0.18,0.5659±0.16 vs 1.0±0.19:均P<0.05). 结论:肝细胞脂变后细胞内TC含量增加,其合成基因表达升高及代谢基因表达降低可能是其机制;LDLR mRNA表达降低.
关键词： 肝细胞脂肪变性 三酯酰甘油 胆固醇 逆转录-聚合酶链反应 -
TFPI-2基因体外诱导胰腺癌Panc-1细胞的凋亡
目的: 将TFPI-2基因转染胰腺癌细胞系Panc-1细胞, 研究其对胰腺癌细胞凋亡的影响.方法:将重组质粒pEGFP-C1-TFPI-2通过脂质体介导转染胰腺癌细胞系Panc-1细胞, G418筛选获得阳性细胞克隆后, 用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)技术分别检测转染细胞中TFPI-2 mRNA及相应蛋白的表达, 同时测定转染细胞的生长曲线和凋亡情况. 结果: 同转染空载体及未转染细胞相比, 转染成功的Panc-1细胞可以检测到TFPI-2 mRNA和相应蛋白的表达, 细胞生长受到抑制(n = 9, P = 0.02), DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的"梯状"条带.结论:外源性TFPI-2基因能够抑制胰腺癌细胞生长增殖、诱导胰腺癌细胞凋亡.
关键词： 胰腺肿瘤 细胞凋亡 组织因子途径抑制物2 免疫印迹 逆转录-聚合酶链反应 -
AG490联合健择对人胰腺癌细胞生长的影响
目的:探讨Janus激酶(JAK)特异性抑制剂AG490联合化疗药物健择对人胰腺癌细胞系SW1990的生长增殖及STAT3转导通路的影响和其机制.方法:人胰腺癌细胞系SW1990分为对照组、AG490组、健择组及AG490+健择处理组.培养48 h后,MTT法检测细胞增殖状态,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot和RT-PCR检测STAT3,Cyclin D1,Bcl-xL,Bax,Survivin的表达情况.结果:AG490组和健择组的细胞增殖明显低于对照组(2.20±0.25,230±0.220 vs 3.78±0.42,P＜0.05),凋亡率明显高于对照组(35.40%±3.08%,34.64%±1.38% vs 16.49%±1.45%,P＜0.05).并且,AG490+健择组细胞增殖(1.49±0.15)明显低于明显低于AG490或健择组(P＜0.05),而凋亡率(43.80%±1.57%)则明显高于AG490或健择组(P＜0.05).AG490处理SW1990 48 h后,p-STAT3表达明显低于对照组(13.83%±0.64% vs 79.87%±1.43%,P＜0.05),同时Cyclin D1(mRNA:15.63%±0.59% vs 43.83%±0.64%,P＜0.05;蛋白:17.50%±0.92% vs 49.87%±1.27%,P＜0.05),Bcl-xL(mRNA:13.93%±0.21% vs 75.70%±0.46%,P＜0.05;蛋白:34.17%±1.70% vs83.93%±0.80%,P＜0.05)和Survivin(mRNA:58.27%±0.42% vs 82.93%±1.68%,P＜0.05;蛋白:13.23%±1.03% vs 18.60±1.08%,P＜0.05)表达也明显降低,而Bax的表达则明显增高(mRNA:10.33%±1.18% vs 5.43%±0.70%,P＜0.05;蛋白:13.07%±1.04% vs 6.23%±2.40%,P＜0.05),健择处理组上述指标与对照组相似.结论:阻断STAT3信号转导通路可以抑制人胰腺癌细胞增殖,促进其凋亡,健择联合AG490能起协同作用.AG490联合健择可能为胰腺癌治疗提供新的思路.
关键词： 胰腺肿瘤 信号转导与转录激活因子3 AG490 增殖 凋亡 MTT法 流式细胞术 免疫印迹 逆转录-聚合酶链反应 -
银杏叶提取物抗大鼠肝纤维化中激活素A和肝细胞凋亡的作用
目的:观察银杏叶提取物(GBE)对大鼠肝纤维化的防治效果及其机制.方法:♂SD大鼠30只随机分为3组:正常对照组(n=10)、模型组(n=10)及GBE干预组(n=10),模型组及GBE干预组给予500mL/L CCl4 ip,l mL/kg,每周2次,共8 wk,干预组每天同时给予GBE灌胃,0.4 g/kg.实验结束后,心脏取血分离血清行肝功能生化指标检测,处死动物取肝脏液氮冻存及甲醛固定,常规行HE染色,免疫组化检测Activin A,RT-PCR检测Activin A mRNA的表达,TUNEL法检测肝细胞凋亡.结果:光镜下组织学检查纤维化分级GBE干预组低于模型组(P＜0.05),肝功能生化指标检测GBE干预组优于模型组(分别为ALT:2806.9±576.1 nkat/L vs 4452.9±709.5nkat/L;AST:5314.2±1042 nkat/L vs 15 743.4±625.8 nkat/L;ALB:31.0±2.1 g/L vs 21.7±1.8 g/L;P均＜0.05),免疫组化和RT-PCR检测Activin A的表达GBE干预组低于模型组(免疫组化:4.2±0.8 vs 11.4±1.2:RT-PCR:0.42±0.09 vs 0.78±0.15;P均＜0.01),凋亡指数(AI)GBE干预组低于模型组(7.56±3.36 vs 16.06±8.84,P＜0.01).结论:GBE对CCl4诱导的大鼠肝纤维化有良好的防治作用,其作用机制可能与肝组织ActivinA表达降低及肝细胞凋亡减少有关.
