RNA干扰沉默CXCR4基因对Jurkat细胞周期和凋亡的影响

本文研究探讨下调CXCR4的表达对人T-ALL Jurkat细胞周期和凋亡的影响.设计合成CXCR4的特异性siRNA,采用脂质体转染Jurkat细胞株.用RT-PCR检测siRNA对细胞内CXCR4基因表达的影响,用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞的凋亡情况.结果表明:成功构建了CXCR4的特异性siRNA;与空白对照组相比,转染CXCR4 siRNA的Jurkat细胞的CXCR4 mRNA表达水平明显下降(56.9%±1.4%vs 68.3%±2.4%),G0/G1期细胞比例增加(35.8%±1.9% vs 18.1%±1.2%),G2/M期和S期细胞比例相应下降(19.8%±1.7% vs27.2%±1.5%;44.4%±2.1% vs 54.7%±2.8%),凋亡细胞率明显增高(20.9%±2.0% vs 3.13%±0.9%).结论:CXCR4的特异性siRNA能够有效下调CXCR4基因表达,诱导Jurkat细胞凋亡和细胞周期阻滞,从而抑制细胞的增殖.

siRNA靶向抑制CXCR4基因表达对鼻咽癌细胞增殖及侵袭的影响及机制研究

目的 探讨抑制鼻咽癌细胞趋化因子受体-4(CXCR4)基因表达对癌细胞增殖、侵袭的影响及机制.方法 回顾性收集鼻咽癌42例临床资料及相应的癌旁组织.RT-PCR和Westernbloting分别检测鼻咽癌及相应的癌旁组织中CXCR4基因的mRNA及蛋白表达;人鼻咽癌细胞系CNE-2Z分为空白组(细胞未做任何处理)、NC-siRNA组(细胞转染无义siRNA序列)和CXCR4-siRNA组(细胞中转染CXCR4的靶向siRNA序列).转染48h后Westernblo-ting检测各组细胞中CXCR4、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期素D1(CyclinD1)蛋白表达;CCK8实验和Transwell小室分别检测细胞的增殖及侵袭能力.结果 鼻咽癌中CXCR4基因的mRNA及蛋白表达均显著高于癌旁组织(P<0.01);转染CXCR4-siRNA组后CXCR4的蛋白表达显著降低;NC-siRNA组细胞存活率、细胞侵袭数及MMP-2、MMP-9、β-catenin、CyclinD1蛋白表达与空白组差异无统计学意义(P>0.05);CXCR4-siRNA组细胞存活率、细胞侵袭数及MMP-2、MMP-9、β-catenin、CyclinD1蛋白表达均显著低于空白组(P<0.01).结论 抑制鼻咽癌细胞CXCR4基因表达可显著降低癌细胞的增殖与侵袭能力,其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关.

趋化性细胞因子受体CXCR4基因沉默对大肠癌细胞体外侵袭及增殖能力的影响

目的:研究趋化性细胞因子受体CXCR4短干扰RNA(siRNA)对大肠癌细胞系体外侵袭及增殖能力的影响.方法:利用T7 RNA聚合酶体外合成以CXCR4为靶基因的siRNA,用脂质体转染大肠癌SW480细胞,同时设立空白对照组和无关对照组.于转染后48 h采用RT-PCR方法检测CXCR4 mRNA水平,免疫印迹方法检测CXCR4和MT1-MMP的蛋白质水平,Bovden小室模型检测体外侵袭能力的变化,流式细胞术检测细胞周期的分布情况,MTT法测定细胞增殖状况.结果:SW480细胞转染CXCR4 siRNA 48 h后,与空白对照和无关对照相比,CXCR4mRNA水平明显下调(51.53%±6.1% vs 78.4%±3.3%,P＜0.01;51.53%±6.1% vs 87.4%±5.3%,P＜0.01),CXCR4的蛋白质水平明显降低(47.3%±3.7% vs 107.2%±3.6%,P＜0.01;47.3%±3.7% vs 114.7%±4.8%,P＜0.01),MT1-MMP蛋白表达水平也明显下降(43.8%±2.5% vs 64.4%±4.4%,P＜0.01;43.8%±2.5% vs 67.0%±2.9%,P＜0.01),细胞的体外侵袭能力减弱(26.5%±6.1% vs 73.7%±3.4%,P＜0.01;26.5%±6.1% vs 64.5%±5.7%,P＜0.01),细胞周期的分布无明显差异.在无SDF-1存在的情况下,各组细胞的增殖无明显改变;经SDF-1刺激后,各组细胞增殖增加,但CXCR4 siRNA转染组细胞的增殖显著低于空白对照组和无关对照组(24 h:0.55±0.03 vs 0.68±0.06,0.71±0.04,P＜0.05;48 h:0.67±0.04 vs 0.89±0.03,0.94±0.07,P＜0.05;72 h:0.72±0.06 vs 1.36±0.08,1.53±0.07,P＜0.01).以上各指标在空白对照和无关对照之间无显著性差异(P＞0.05).结论:以CXCR4为靶向的siRNA能够有效下调CXCR4基因,降低SDF-1诱导的大肠癌细胞系体外侵袭能力及增殖活性.

趋化性细胞因子受体CXCR4基因沉默对乳腺癌细胞体外侵袭和定向肺转移的影响

目的 利用RNA干扰技术下调趋化性细胞因子受体CXCR4基因的表达,探讨其沉默对乳腺癌细胞体外侵袭及肺转移潜能的影响.方法 设计合成CXCR4的特异性短发卡状RNA(shRNA),将其插入至pSilencer载体中,并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染乳腺癌MDA-MB-231细胞株,抗性筛选稳定抑制CXCR4表达的永久细胞克隆.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法,检测shRNA对细胞内CXCR4基因表达的影响.利用Boyden小室模型检测细胞体外侵袭能力.二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖状况.通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法,构建肺转移模型,检测CXCR4基因沉默对乳腺癌细胞肺转移能力的影响.结果 成功构建和筛选出CXCR4特异性的shRNA质粒载体,稳定转染CXCR4-shRNA的乳腺癌细胞的CXCR4 mRNA和蛋白的表达较空白对照组明显下调(29.5%±3.8%比69.7%±2.6%,15.4%±1.1%比39.0%±2.4%;均P<0.01),体外侵袭能力减弱,增殖速度减慢,肺转移能力下降.结论 以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达,降低人乳腺癌细胞体外侵袭、增殖以及肺转移的能力.CXCR4是乳腺癌侵袭和转移过程中的重要调控因子.

慢病毒载体介导的CXCR4基因过表达骨髓间充质干细胞在防治小鼠移植物抗宿主病中的作用

目的 探讨小鼠CXC型趋化因子受体4(CXCR4)基因过表达的骨髓间充质干细胞(MSC)防治小鼠移植物抗宿主病(GVHD)作用.方法 利用慢病毒载体构建过表达小鼠CXCR4基因的重组慢病毒载体,包装病毒后转导小鼠骨髓间充质干细胞(CXCR4-MSC).以C57BL/6小鼠为供鼠,BALB/c小鼠为受鼠,建立小鼠异基因骨髓移植(BMT)模型,同时输注骨髓MSC.分5组:全身照射(TBI)组:仅接受TBI; BMT组:TBI组输注小鼠骨髓细胞;GVHD组:BMT组输注异基因脾细胞;EGFP-MSC组:GVHD组输注EGFP-MSC; CXCR4组:GVHD组输注CXCR4-MSC.观察受鼠生存状态,统计生存率,观察受鼠组织病理学改变及炎症细胞因子变化,评价其对GVHD防治作用.结果 TBI组小鼠在照射后14d内均死于造血衰竭,BMT组受鼠可获长期存活,GVHD组、EGFP-MSC组和CXCR4-MSC组生存时间分别为(1 7.0±2.3)、(21.7±4.8)、(30.1±9.1)d,CXCR4-MSC共移植组受鼠存活时间明显长于GVHD组(P＜0.05).各组受鼠均出现腹泻、弓背、翘毛、皮肤缺损、体重减轻等GVHD症状,共移植CXCR4-MSC组受鼠临床评分低于GVHD组(P＜0.05).GVHD组与EGFP-MSC组受鼠肝脏、小肠与皮肤均存在典型GVHD病理改变,CXCR4-MSC组仅发生Ⅰ～Ⅱ度病理改变,受鼠组织病理评分低于以上两组.移植后第14天,各组受鼠促炎症因子水平明显升高,CXCR4-MSC组IFN-γ、IL-2、TNF-α水平明显低于GVHD组与EGFP-MSC组(P＜0.05).结论 联合输注CXCR4过表达的骨髓MSC可通过降低受鼠移植后炎症因子分泌从而减轻GVHD.

过表达CXCR4基因对人脐带间充质干细胞迁移作用的影响

[目的]通过transwell趋化实验,观察经慢病毒转染后过表达CXCR4的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUMSCs)是否具有更好的迁移作用.[方法]通过组织贴壁法,分离和培养来源于人脐带华通胶组织中的MSCs.经慢病毒转染,将CXCR4目的基因转染至第3代HUMSCs,并进行免疫荧光、western blotting检测在HUMSCs中表达CXCR4基因的情况.通过transwell小室进行HUMSCs的趋化迁移试验检测,观察转染CXCR4基因后的HUMSCs迁移能力是否增强.[结果]自脐带分离培养的HUMSCs通过慢病毒转染后,可过表达CXCR4基因.Transwell试验发现,过表达CXCR4的HUMSCs较正常HUMSCs和未转染目的基因的HUMSCs,迁移的细胞数明显增加(P＜0.05).[结论]通过慢病毒转染过表达CXCR4的HUMSCs,其趋化、迁移能力明显增强.

2例儿童先天性粒细胞减少症的基因诊断

目的 提高对先天性粒细胞减少症(CN)的认识,通过检测基因突变类型,探讨其分子学发病机制.方法 使用DNA直接测序法分析患儿全基因组,分析其有意义的突变类型,查找数据库进行相应序列对比,再进行一代测序(Sanger法)验证.结果 先证者一存在G6PC3基因存在双重杂合子突变:IVS3+1G>T及c.915(E6):缺失G,先证者二存在CXCR4基因突变:c.1004(exon1)-c.1005(exon1)缺失AA.结论 2例先天性粒细胞减少症的患儿均存在异常的基因突变,基因诊断对先天性粒细胞减少症的诊断有重大意义,对临床研究及治疗提供依据.

shRNA-CXCR4对人乳腺癌细胞增殖活性的影响

背景与目的:CXCR4是趋化细胞因子SDF-1(基质细胞衍生因子-1)的受体.CXCR4/ SDF-1轴在肿瘤侵袭,转移中具有重要作用.阻断CXCR4/ SDF-1轴,有可能成为一个新的肿瘤治疗标靶. 本研究拟探讨shRNA- CXCR4对人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s细胞增殖活性的影响.方法:通过质粒shRNA-CXCR4沉默CXCR4基因后,RT-PCR,Western blot检测3株人乳腺癌细胞的CXCR4mRNA及其蛋白的表达;MTT,流式细胞仪检测它们的增殖.结果:质粒shRNA-CXCR4作用于3株人乳腺癌细胞后能明显抑制其CXCR4基因的mRNA(MDA-MB-231:实验组CXCR4/GAPDH为0.152,空白组和阴性对照组分别为0.40及0.45,MDA-MB-435s:实验组为0.198,空白对照组和阴性对照组分别为0.690及0.775,MCF-7:实验组为0.089,空白对照组和阴性对照组分别为0.327及0.313)及蛋白表达水平(MDA-MB-231:实验组CXCR4/β-actin为0.153,空白组和阴性对照组分别为0.829及0.878,MDA-MB-435s:实验组为0.173,空白对照组和阴性对照组分别为0.877及0.906,MCF-7:实验组为0.177,空白对照组和阴性对照组分别为0.911及0.874)(P〈0.05);MTT显示能明显抑制3株人乳腺癌细胞的增殖(P〈0.05);流式细胞仪显示3株人乳腺癌细胞S期细胞数量明显减少(P〈0.05),将更多的细胞阻滞在G0/G1期(P〈0.05).结论:shRNA- CXCR4作用于CXCR4基因后能明显抑制人乳腺癌细胞生长和增殖.可能是治疗乳腺癌的一个潜在治疗靶点.

关于《肾癌转移相关CXCR4基因核定位序列的初步研究》一文的更正

基于靶向基因测序的原发性免疫缺陷病基因诊断方法

目的· 设计并建立基于靶向基因测序(TPS)的适合原发性免疫缺陷病(PID)的高通量基因诊断方法.方法· 阅读文献并查询相关数据库确定PID的已知致病基因,设计并定制针对这些基因所有外显子及侧翼序列的捕获探针,并通过该方法对1例疑似PID患儿进行分子诊断.结果·该PID测序panel共包含100个已知致病基因.该疑似PID患儿测序结果共产生读条数16414298(reads),平均覆盖深度为157 X,98.35%的目标区域测序深度大于20 X,99.97%的目标区域具有1 X以上的测序深度.终在患儿的CXCR4基因第2号外显子区域发现一个杂合的无义突变(c.1000C>T,p.Arg334*).Sanger测序结果验证了患儿CXCR4基因的变异并表明其父母在相应位点均为野生型,证实了患儿CXCR4基因的变异为新生突变(de novo).结论·建立了PID高通量基因诊断方法,并借助该靶向基因测序技术成功诊断1例WHIM综合征患儿.

CXCR4基因转染的猪BMSCs体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的:探讨基质细胞衍生因子-1(SDF-1)受体CXCR4基因转染的猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外诱导分化为心肌样细胞的可行性.方法:按照Nance方法培养BMSCs,转染带荧光的CXCR4基因,流式细胞仪检测转染后BMSCs的细胞周期,用5-氮胞苷(5-aza)诱导,并行结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I免疫组化鉴定.对照组为未转染CXCR4基因的BMSCs.结果:体外培养的原代BMSCs 10～14d达到融合,CXCR4基因转染后的BMSCs能成功表达CXCR4,转染前后细胞周期无明显改变.与对照组相同,经5-aza刺激后,部分BMSCs成梭形,结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I免疫组化染色均为阳性.结论:CXCR4基因转染的猪BMSCs在体外条件下生长稳定,传代后仍保持未分化状态,有分化成心肌样细胞的潜能.

壳聚糖介导RNA干扰沉默CXCR4基因对食管癌细胞增殖、侵袭力的影响

目的 探讨沉默CXCR4基因对食管鳞癌EC109细胞体外增殖、侵袭能力的影响.方法 化学合成两对针对CXCR4基因的干扰序列(实验序列、对照序列),构建表达小发夹RNA(shRNA)的质粒,以壳聚糖为基因载体转染人食管癌EC109细胞.荧光显微镜观测转染效率,Western blot法分析转染前后CXCR4蛋白的变化,集落形成实验检测细胞增殖能力,transwell侵袭小室检测细胞侵袭能力,ELISA法检测转染前后EC109细胞上清液血管内皮细胞生长因子(VEGF)水平的变化.结果 酶切电泳、测序证实成功构建靶向CXCR4基因的shRNA表达质粒.以壳聚糖为载体转染HEK293A,转染效率达80％以上.与空白对照组、实验对照组比较:转染实验组质粒能明显下调CXCR4蛋白表达;抑制EC109细胞增殖,影响其集落形成能力;降低EC109细胞穿膜数目,影响其侵袭能力;时间依赖性降低EC109细胞上清液中VEGF水平,转染48 h及72 h后与空白对照组、实验对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CXCR4基因在食管癌细胞生长、侵袭方面发挥重要作用,沉默其表达可降低食管癌细胞增殖,抑制肿瘤细胞集落形成和侵袭能力,抑制细胞分泌VEGF能力.CXCR4基因有可能成为食管癌治疗新的、有效靶点.

基质细胞衍生因子-1及其受体 CXCR4对膀胱癌细胞侵袭能力及腔内种植的影响

目的：复发和转移是膀胱癌治疗失败的主要原因。文中利用RNA干扰技术使趋化性细胞因子受体CXCR4基因沉默，探讨其沉默对膀胱癌细胞侵袭能力及腔内种植的影响。方法设计合成CXCR4的特异性短发卡状RNA （ short hairpin， shRNA），筛选出能够稳定抑制CXCR4表达的细胞，并分为空白对照组、阴性对照质粒组、pshRNA-CXCR4-1实验组， pshRNA-CXCR4-2实验组，应用RT-PCR和免疫荧光分别检测CXCR4 mRNA和蛋白表达水平，应用Boyden小室模型检测体外侵袭能力的变化。将20只裸小鼠随机数表法分为实验裸小鼠和对照裸小鼠，各10只。向实验裸小鼠膀胱内注入100μL ShRNA-EJ-M3，向对照裸小鼠膀胱内注入100μL EJ-M3细胞，检测shRNA-CXCR4对膀胱癌细胞腔内种植能力的影响。结果稳定转染后的pshRNA-CXCR4-1实验组CXCR4 mRNA表达（62．05±1．35）较空白对照组（174．38±1．96）和阴性对照组（166．27±1．82）明显下降（P＜0．05），pshRNA-CXCR4-2实验组CXCR4 mRNA表达水平（182．58±4．2）与空白对照组和阴性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）；免疫荧光实验中pshRNA-CXCR4-1实验组红色免疫荧光细胞数（32．24±2．23）较空白对照组（89．61±4．47）和阴性对照组（92．45±3．68）降低（P＜0．05）；pshRNA-CXCR4-2实验组红色免疫荧光细胞数（76．87±5．11）与空白对照组和阴性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。体外趋化侵袭实验结果显示，pshRNA-CXCR4-1实验组穿膜细胞数（39．67±8．45）明显少于空白对照组（135．33±9．28）及阴性对照组（123．63±6．36），差异有统计学意义（P＜0．05）。实验裸小鼠腔内种植能力与对照裸小鼠比较，差异有统计学意义（10％ vs 70％，P＜0．01）。结论以CXCR4为靶向的特异性shRNA能有效抑制膀胱癌细胞基因CXCR4的表达，显著降低膀胱癌细胞体外侵袭能力及腔内种植能力，SDF-1/CXCR4生物轴有望成为预防和治疗膀胱癌侵袭和转移的重要靶点之一。

AEG-1与CXCR4对乳腺癌脑转移的影响

目的 探讨AEG-1与CXCR4基因表达对乳腺癌脑转移的影响.方法 对1997～2007年收治的乳腺癌患者进行随访,以发生脑转移的33例患者作为病例组,以未发生脑转移的45例患者作为对照组.通过免疫组化法,对照分析AEG-1及CXCR4对脑转移的影响.结果 脑转移组中AEG-1及CXCR4的阳性表达率分别为63.6%和60.6%,与其在对照组中表达(31.1%和33.3%)差异显著(P<0.05).logistic回归分析结果显示,AEG-1和CXCR4回归系数分别为1.242和1.545.结论 AEG-1和CXCR4阳性表达是乳腺癌发生脑转移的独立危险因子,AEG-1及CXCR4有望成为针对乳腺癌脑转移的高特异性早期诊断指标及基因治疗靶点.

转染CXCR4基因支气管上皮细胞向SDF-1的迁移观察

目的 观察转染趋化因子受体CXCR4的人支气管上皮细胞HBE向趋化因子SDF-1的定向迁移情况.方法 免疫荧光和流式细胞仪检测正常HBE细胞中的CXCR4蛋白.构建CXCR4慢病毒表达载体并转染HBE细胞.实时荧光定量PCR和Western blot检测转染CXCR4的HBE细胞中的CXCR4mRNA和蛋白,通过Transwell小室实验观察该细胞向SDF-1的定向迁移情况.结果 正常HBE细胞的CXCR4蛋白表达量较低.成功构建了CXCR4慢病毒表达载体.转染CXCR4的HBE细胞中CXCR4 mRNA和蛋白都有较高水平的表达,且向SDF-1定向迁移的细胞数[SDF-1终浓度分别为1、3、10、30、100、300 nM时到达膜背面的细胞分别为(42.8±2.8)、(47.6±6.2)、(57.8±3.3)、(62.4±5.0)、(89.8±4.7)、(100.0±4.8)、(62.4±5.0)个]较未加入SDF-1时的细胞数[(32.8±2.2)个]显著增加(P均＜0.05),并呈浓度依赖性(P＜0.05).结论 转染趋化因子受体CXCR4的HBE细胞向趋化因子SDF-1的定向迁移明显增加.

shRNA-CXCR4作用于CXCR4基因对乳腺癌血管生成潜力的影响

目的 研究shRNA-CXCR4作用于CXCR4基因对人乳腺癌细胞株诱导血管内皮细胞形成管腔能力的影响.方法 通过质粒shRNA-CXCR4沉默CXCR4基因后,RT-PCR、Western-blot检测3株人乳腺癌细胞的CXCR4 mRNA及其蛋白的表达;应用人乳腺癌细胞株与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)双室联合培养技术,观察人乳腺癌细胞株通过shRNA-CXCR4作用于CXCR4基因后诱导HUVEC形成管腔能力的影响.结果 质粒shRNA-CXCR4作用于3株人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-435S、MCF-7后能明显抑制其CXCR4基因的mRNA及蛋白表达水平:对乳腺癌细胞诱导的人脐静脉血管内皮细胞HUVEC形成管腔样结构的能力有显著的抑制作用(P<0.05).结论 shRNA-CXCR4作用于CXCR4基因后能明显抑制人乳腺癌细胞诱导管腔形成能力.

CXCR4 shRNA对U87胶质瘤细胞周期和凋亡的影响

目的 探讨下调CXCR4的表达对U87胶质瘤细胞周期和凋亡的影响,为CXCR4 shRNA治疗胶质瘤提供实验依据.方法 设计合成CXCR4的特异性shRNA,采用脂质体转染U87细胞株.实验将细胞分为空白对照组(A组),阴性对照组(转染非特异载体pGPU6/GFP/NC组)(B组),实验组(转染CXCR4-shRNA组)(C组)共三组,用RT-PCR检测各组细胞CXCR4基因表达情况,用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞的凋亡情况.结果 成功构建了CXCR4的特异性shRNA.C组的U87细胞CXCR4mRNA为(42.5±4.6)％,显著低于B组的(65.4±5.9)％和A组的(69.6±7.4)％(P＜0.05),G0/G1期细胞比例增加(39.4±1.7)％与(25.8±1.3)％和(20.3±1.2)％,G2/M期细胞比例相应下降(20.2±1.6)％与(30.1±1.2)％和(26.4± 1.3)％;S期细胞比例相应下降(46.5±2.7)％与(55.7±2.8)％和(54.9±2.6)％,凋亡细胞率为(18.68±0.44)％明显高于A组(5.14±0.23)％和B组(4.87±0.16)％(P＜0.05).结论 CXCR4shRNA能够有效下调U87细胞CXCR4基因表达,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞,从而抑制细胞的增殖,提示CXCR4在胶质瘤发展过程中具有重要作用.

siRNA沉默人乳腺癌细胞株CXCR4基因的实验研究

目的 探讨shRNA- CXCR4对人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s细胞CXCR4基因表达及蛋白表达的影响.方法 通过shRNA-CXCR4沉默CXCR4基因后,RT-PCR、Western blotting检测3株人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s的CXCR4 mRNA及其蛋白的表达.结果 shRNA-CXCR4作用于人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s后能明显抑制其CXCR4基因的mRNA及蛋白表达水平(P＜0.05).结论 shRNA-CXCR4能特异性抑制乳腺癌细胞的CXCR4 mRNA及其蛋白的表达.

转染CXCR4的MSCs对放射性肺损伤组织中细胞因子的影响

目的 观察慢病毒转染CXCR4的间充质干细胞(MSCs)对放射性肺损伤小鼠肺组织内细胞因子的影响.方法 将C57小鼠分为正常组、照射组、对照组和治疗组,除正常组外,其他各组均经直线加速器进行X射线(13 Gv,3.68 Gy/min)一次性全肺照射.之后对照组经尾静脉注射仅经慢病毒转染EGFP的MSCs,治疗组经尾静脉注射经慢病毒转染CXCR4和EGFP的MSCs.在X线照射后7d,分别留取各组的肺组织标本,荧光显微镜下观察肺内EGFP标记的MSCs分布情况,并行病理组织学HE染色,ELISA法检测各组肺组织内羟脯胺酸(HYP)、丙二醛(MDA)、10 kDa干扰素γ诱导蛋白(IP-10)、转化生长因子β1 (TGF-β1)、血小板源生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和基质金属蛋白酶(MMPs)-2表达水平.结果 治疗组肺组织内EGFP标记的MSCs分布多于对照组.与照射组比较,对照组和治疗组肺组织损伤减轻,两组的肺组织中HYP、MDA、IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α和MMP-2表达水平明显下降(P＜0.01).相对于对照组,除TNF-α外,治疗组上述指标水平下降的更明显(P＜0.01).结论 转染CXCR4的MSCs在放射性肺损伤小鼠肺组织内数量增加,并具有更好地减轻放射性肺损伤效果,可有效抑制放射损伤引起的肺组织IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α和MMP-2细胞因子的升高.

CXCR4基因慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

目的：构建CXCR4基因慢病毒过表达载体并对其进行包装、鉴定。方法首先设计合成引物,采用PCR法扩增目的基因CXCR4,将目的基因与酶切线性化的载体进行定向交换,成功构建重组载体慢病毒表达载体pGC-FU-CXCR4,将其产物转化大肠杆菌感受态细胞。对培养出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,后将获得的病毒载体共同转染293T细胞,收集病毒颗粒,并采用Real time PCR法测定病毒滴度。结果 PCR鉴定结果显示扩增的目的基因已成功插入pGC-FU载体,Western Blot结果显示得到的片段与理论大小相符,阳性克隆测序结果与目的基因序列一致,说明重组慢病毒载体的插入序列完全正确。结论本实验成功构建了CXCR4慢病毒表达载体,并成功对慢病毒进行了包装及病毒滴度测定。