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趋化性细胞因子受体CXCR4基因沉默对乳腺癌细胞体外侵袭和定向肺转移的影响
目的 利用RNA干扰技术下调趋化性细胞因子受体CXCR4基因的表达,探讨其沉默对乳腺癌细胞体外侵袭及肺转移潜能的影响.方法 设计合成CXCR4的特异性短发卡状RNA(shRNA),将其插入至pSilencer载体中,并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染乳腺癌MDA-MB-231细胞株,抗性筛选稳定抑制CXCR4表达的永久细胞克隆.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法,检测shRNA对细胞内CXCR4基因表达的影响.利用Boyden小室模型检测细胞体外侵袭能力.二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖状况.通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法,构建肺转移模型,检测CXCR4基因沉默对乳腺癌细胞肺转移能力的影响.结果 成功构建和筛选出CXCR4特异性的shRNA质粒载体,稳定转染CXCR4-shRNA的乳腺癌细胞的CXCR4 mRNA和蛋白的表达较空白对照组明显下调(29.5%±3.8%比69.7%±2.6%,15.4%±1.1%比39.0%±2.4%;均P<0.01),体外侵袭能力减弱,增殖速度减慢,肺转移能力下降.结论 以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达,降低人乳腺癌细胞体外侵袭、增殖以及肺转移的能力.CXCR4是乳腺癌侵袭和转移过程中的重要调控因子.
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三位点短发卡状RNA在提高RNA干扰效率中的作用
背景与目的:shRNA技术是近来发展的热点技术之一,但普遍采用的单位点shRNA干扰载体效果并不理想.本研究探讨三位点短发卡状RNA在提高RNA干扰效率中的作用.方法:构建外源基因DsRed全长载体转染HEK293细胞.针对报告基因DsRed设计4个干扰载体,一个含有3段shRNA,另外3个分别含有此3段中1段shRNA.转染293/DsRed,荧光显微镜观察基因DsRed.应用实时定量PCR(Real-time PCR)和流式细胞仪(FACS)检测4个载体对DsRed基因在mRNA及蛋白水平干扰效应.结果:4个载体对靶基因DsRed在mRNA及蛋白水平均有干扰效应,且含有3段shRNA载体对DsRed基因干扰效率为(89±16)%,显著高于3个只含有1段shRNA载体[(50±23)%,(52±15)%,(55±27)%],差异有显著性(P<0.05).结论:三位点shRNA干扰载体可以提高对靶基因的干扰效率.
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质粒介导的短发卡状RNA特异性抑制大肠癌cerb-B1基因的表达
目的:体外构建编码人类基因cerb-B1短发卡状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的质粒表达载体,观察其对结肠癌LoVo细胞cerb-B1基因和表皮生长因子受体(EGFR)蛋白的特异性抑制作用.方法:体外合成cerb-B1基因的DNA模板引物,和Pgenesil-1质粒构建编码shRNA的表达载体.应用脂质体Lipofectamine 2000转染人结肠癌LoVo细胞,转染成功后以G418筛选4周,实时荧光定量RT-PCR(Real Time RT-PCR)检测cerb-B1基因的mRNA表达,Western-blot检测EGFR蛋白的表达.结果:质粒载体经酶切鉴定证实DNA模板插入质粒成功,且测序与设计结果相符,成功的构建了针对原癌基因cerb-B1的质粒表达载体.质粒载体成功转染后,cerb-B1基因mRNA表达下降了(81.3±2.8)%,EGFR蛋白表达下降了(73.4±2.3)%,和对照质粒载体组比较有显著性差异.结论:说明本研究构建的针对cerb-B1基因的质粒表达载体可以显著抑制cerb-B1基因和EGFR蛋白在人结肠癌LoVo细胞的表达,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路.
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靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定
目的 构建靶向表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shRNA)质粒表达载体并进行鉴定.方法 ①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆.结果 ①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对 EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆.结论 利用 RNAi技术原理成功构建针对 EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞.
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基质细胞衍生因子-1及其受体 CXCR4对膀胱癌细胞侵袭能力及腔内种植的影响
目的：复发和转移是膀胱癌治疗失败的主要原因。文中利用RNA干扰技术使趋化性细胞因子受体CXCR4基因沉默，探讨其沉默对膀胱癌细胞侵袭能力及腔内种植的影响。方法设计合成CXCR4的特异性短发卡状RNA （ short hairpin， shRNA），筛选出能够稳定抑制CXCR4表达的细胞，并分为空白对照组、阴性对照质粒组、pshRNA-CXCR4-1实验组， pshRNA-CXCR4-2实验组，应用RT-PCR和免疫荧光分别检测CXCR4 mRNA和蛋白表达水平，应用Boyden小室模型检测体外侵袭能力的变化。将20只裸小鼠随机数表法分为实验裸小鼠和对照裸小鼠，各10只。向实验裸小鼠膀胱内注入100μL ShRNA-EJ-M3，向对照裸小鼠膀胱内注入100μL EJ-M3细胞，检测shRNA-CXCR4对膀胱癌细胞腔内种植能力的影响。结果稳定转染后的pshRNA-CXCR4-1实验组CXCR4 mRNA表达（62．05±1．35）较空白对照组（174．38±1．96）和阴性对照组（166．27±1．82）明显下降（P＜0．05），pshRNA-CXCR4-2实验组CXCR4 mRNA表达水平（182．58±4．2）与空白对照组和阴性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）；免疫荧光实验中pshRNA-CXCR4-1实验组红色免疫荧光细胞数（32．24±2．23）较空白对照组（89．61±4．47）和阴性对照组（92．45±3．68）降低（P＜0．05）；pshRNA-CXCR4-2实验组红色免疫荧光细胞数（76．87±5．11）与空白对照组和阴性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。体外趋化侵袭实验结果显示，pshRNA-CXCR4-1实验组穿膜细胞数（39．67±8．45）明显少于空白对照组（135．33±9．28）及阴性对照组（123．63±6．36），差异有统计学意义（P＜0．05）。实验裸小鼠腔内种植能力与对照裸小鼠比较，差异有统计学意义（10％ vs 70％，P＜0．01）。结论以CXCR4为靶向的特异性shRNA能有效抑制膀胱癌细胞基因CXCR4的表达，显著降低膀胱癌细胞体外侵袭能力及腔内种植能力，SDF-1/CXCR4生物轴有望成为预防和治疗膀胱癌侵袭和转移的重要靶点之一。
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靶向XT-1基因shRNA真核表达质粒载体的构建及筛选
目的 构建靶向木糖转移酶-1(XT-1)的短发卡状小干扰 RNA(shRNA)质粒表达载体;为寻找脊髓损伤治疗的新靶点提供工具.方法 设计4个小分子短发卡状RNA(siRNA)序列,体外合成DNA模板引物,与Pgenesil-1质粒构建成编码shRNAR 的表达载体,进行酶切和测序,再转染体外培养的星形胶质细胞,筛选靶序列.结果 构建的质粒表达载体完全符合设计要求,转染成功的细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光,G418可以筛选出阳性克隆.结论 成功构建了编码 XT-1-shRNA的质粒表达载体;该载体为寻找脊髓损伤治疗的新靶点奠定了基础.
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靶向表皮生长因子受体shRNA质粒表达载体的构建和鉴定
目的 构建靶向表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shRNA)质粒表达载体并进行鉴定.方法 设计两个小分子干扰RNA(siRNA)序列,体外合成DNA模板引物,与Pgenesil-1质粒构建成编码shRNA的表达载体,进行酶切鉴定和测序,再转染人大肠癌LoVo细胞,进行荧光摄像和G418抗性筛选.结果 构建的质粒表达载体完全符合设计要求,转染成功的细胞在荧光显微镜下显示为绿色,G418可以筛选出阳性克隆.结论 成功构建了编码EGFR-shRNA的质粒表达载体,并可以进行稳定筛选.
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重组结缔组织生长因子shRNA质粒的构建及其对肝星状细胞基因表达的影响
[目的]构建同时干扰大鼠结缔组织生长因子(CTGF)2个不同基因位点的shRNA质粒,并将其转染肝星状细胞(HSC),研究其对CTGF基因表达的影响.[方法]针对大鼠CTGF mRNA靶向序列设计并合成2对DNA模版序列,用PCR的方法将2条CTGF靶向特异性的shRNA分别链接到质粒pGenesil1.2载体的U6启动子和H1启动子.将构建的干扰质粒以阳离子脂质体法转染HSC T6细胞,应用RT-PCR及Western Blot检测CTGF的表达.[结果]成功构建CTGF shRNA重组质粒;通过RT-PCR和Western Blot分析发现干扰质粒组的CTGF mRNA与蛋白表达水平明显下降(P＜0.05).[结论]重组CTGFshRNA能有效抑制HSC中CTGF的表达.
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短发卡状RNA特异性抑制表皮生长因子受体对大肠癌细胞凋亡的影响
目的 体外构建编码人类表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shRNA)的质粒表达载体,观察其对结肠癌LoVo细胞EGFR的特异性抑制作用以及对细胞凋亡的影响.方法 体外合成EGFR的DNA模板引物和Pgenesil-1质粒构建编码shRNA的表达载体.应用脂质体Lipofectamine 2000转染人结肠癌LoVo细胞,转染成功后以G418筛选4周,实时荧光定量RT-PCR(real time RT-PCR)和Western-blot检测EGFR的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 成功的构建了针对EGFR的质粒表达载体.质粒载体成功转染后,EGFR mRNA表达下降了(81.3±2.8)%,蛋白表达下降了(73.4±2.3)%,细胞凋亡增加了(10.1±0.4)%,和对照质粒载体比较差异有统计学意义.结论 我们构建的针对EGFR的质粒表达载体可以显著抑制其在人结肠癌LoVo细胞的表达,诱导细胞凋亡,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路.
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靶向人肝素酶短发卡状RNA表达载体的构建及其沉默作用
目的 构建靶向人肝素酶(HPSE)的短发卡状RNA(shRNA)表达载体,探讨其基因沉默作用.方法 根据人肝素酶mRNA序列设计shRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil-1载体,转化扩增后进行测序鉴定;重组质粒在阳离子脂质体Lipofectamine 2000的介导下,瞬时转染人胃癌细胞株SGC-7901、人前列腺癌细胞株PC-3、人膀胱癌细胞株EJ,每种细胞分别设空白对照组、空载体pGenesil-Negative转染组、pGenesil-HPSE shRNA转染组3组,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测各种细胞中肝素酶基因表达水平,黏附实验和transwell小室实验检测癌细胞游走、侵袭能力.结果 所构建的shRNA载体插入基因片段与设计序列完全匹配,载体构建成功;重组质粒转染SGC-7901、PC-3、EJ细胞后,肝素酶mRNA表达分别下调78.6%(P<0.01)、82.6%(P<0.01)、81.9%(P<0.01),肝素酶蛋白表达分别下调76.4%(P<0.01)、85.9%(P<0.01)、83.3%(P<0.01),细胞黏附能力分别下降37.7%(P<0.01)、44.6%(P<0.01)、43.8%(P<0.01),细胞侵袭能力分别下降66.8%(P<0.01)、76.6%(P<0.01)、80.5%(P<0.01).结论 成功构建了靶向人肝素酶的shRNA表达载体,沉默肝素酶基因表达后,能抑制多种癌细胞的游走和侵袭能力.
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shRNA介导GSTP1基因沉默对激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145的影响
目的:探讨谷胱甘肽巯基转移酶P1 (glutathione S-transferase P1,GSTP1)基因沉默对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145增殖活性和对化学治疗药物敏感性的影响.方法:根据选取靶序列形成短发卡状RNA(short hairpinRNA,shRNA)的DNA模板设计3条表达载体(shRNA255,shRNA554,shRNA593),并克隆到质粒pGPU6/GFP/Neo.经酶切和测序鉴定,筛选转染率高基因沉默效果好的shRNA作RNA干扰.DU145细胞株分为空白质粒转染组和shRNA转染组.转染前后按化学治疗药物分为氟尿嘧啶(fluorouracil,FU)组及紫杉醇(paclitaxel,PA)组,并按作用浓度(FU:30,60,120,240 μg/mL; PA:0.2,2,10,20μg/mL)分别分成4个亚组,并分别设有一个空白对照组.四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]比色法检测转染后细胞增殖活性的变化,MTT及末端脱氧核苷酸转移酶介导脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法(terminal de-oxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测转染前后不同浓度FU和PA对DU145细胞抑制增殖及诱导凋亡的效果.结果:3条表达载体(pGPU6/GFP/Neo-shRNA255,pGPU6/GFP/Neo-shRNA554,pGPU6/GFP/Neo-shRNA593)的转染率分别为(63.3±1.04)％,(76.2±0.68)％,(72.7±0.33)％,shRNA554转染率高,三者之间比较差异有统计学意义(P＜0.01).转染后mRNA含量分别为128.31±2.50,43.24±4.30和85.62±6.30,GSTP1蛋白含量分另为163.92±12.40,65.38±9.30和114.25±16.70,shRNA554转染后GSTP1基因mRNA和蛋白含量均低,三者比较差异有统计学意义(P＜0.01).MTT检测转染前FU不同浓度(30,60,120,240 μg/mL)四个亚组作用后细胞存活率分别为(95.60±2.11)％,(90.20±0.86)％,(83.10±3.12)％和(74.60±1.32)％；转染后存活率为(91.30±1.43)％,(84.6±2.13)％,(73.2±1.52)％和(65.5±0.94)％.TUNEL检测转染前FU不同浓度(30,60,120,240.μg/mL)四个亚组作用后细胞凋亡率分别为(5.50±0.88)％,(10.20±1.64)％,(15.20±2.39)％和(25.10±2.59)％；转染后凋亡率(10.80±0.62)％,(15.70±1.32)％,(20.40±1.89)％和(34.90±2.54)％.转染后相同FU浓度下细胞存活率降低,凋亡率增加,差异均具有统计学意义(p＜0.01).MTT检测转染前PA不同浓度(0.2,2,10,20 μg/mL)四个亚组作用后细胞存活率为(98.50±2.34)％,(95.20±1.32)％,(89.40±0.68)％和(82.70±1.73)％；转染后存活率为(94.2±0.78)％,(86.5±2.13)％,(78.7±1.34)％和(70.1±0.76)％.TUNEL检测转染前PA不同浓度(0.2,2,10,20 μg/mL)四个亚组作用后细胞凋亡率分别为(2.4±1.07)％,(5.2±1.33)％,(10.5±2.41)％和(20.7±1.92)％；转染后凋亡率(5.46±2.13)％,(13.8±1.24)％,(21.2±2.39)％和(29.2±2.21)％.转染后相同PA浓度下细胞存活率降低,凋亡率增加,差异均具有统计学意义(P＜0.01).结论:shRNA介导的GSTP1基因沉默可抑制雄激素非依赖型前列腺癌DU145细胞增殖活性,诱导凋亡,并且其作用呈现时间依赖性,可提高其对于化学治疗的药物敏感性.
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RNA干扰技术抑制鼻咽癌细胞内源性绿色荧光蛋白的表达
目的:建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的鼻咽癌细胞株;观察不同转染浓度的短发卡状RNA对鼻咽癌细胞内源性GFP的抑制效率及细胞毒性.方法:转染pEGFP-N1至鼻咽癌细胞株HNE1,G418筛选获得稳定表达GFP的HNE1-GFP细胞株;利用针对GFP基因的短发卡状RNA表达载体shGFP,以不同浓度shGFP转染HNE1-GFP,荧光显微镜观察细胞荧光强度,软件分析荧光抑制效率,MTT检测细胞毒性,RT-PCR检测GFPmRNA水平改变,Western Blot检测GFP蛋白水平改变.结果:绿色荧光稳定表达于传代HNE1细胞中;shGFP能够显著抑制该细胞中GFP的表达,抑制效率分别为49.7%,84.8%,86.7%且无细胞毒性;GFP在mRNA和蛋白水平的表达均有明显下降.结论:稳定表达GFP的鼻咽癌细胞株成功建立;RNA干扰载体可抑制鼻咽癌细胞中GFP的表达,其抑制效率有明显的浓度依赖性且无明显细胞毒性.该系统能够用于鼻咽肿瘤的RNA干扰机制研究中.
