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磷酸化组蛋白预测肝癌细胞对某些化疗药物的敏感性
目的:探讨以磷酸化组蛋白(phosphorylated H2AX,γH2AX)为检测指标预测肝癌细胞HepG2.215对依托泊苷、多柔比星、丝裂霉素和顺铂等化疗药物敏感性的可行性和可靠性.方法:分别以质量浓度指数梯度为1、2、4、20的依托泊苷、多柔比星、丝裂霉素和顺铂等4种化疗药物作用于肝癌细胞HepG2.215,以无药物作用的肝癌细胞为对照组,采用流式细胞术(FCM)检测肝癌细胞中γH2AX阳性表达细胞的百分数,采用免疫细胞化学法检测肝癌细胞内形成的γH2AX灶点数,采用MTT比色法检测化疗药物作用对肝癌细胞增殖的抑制率.分析4种药物作用下肝癌细胞中γH2AX灶点数与γH2AX阳性细胞百分数的相关性;分析各药物不同的质量浓度与肝癌细胞中γH2AX阳性细胞百分数γH2AX灶点数,以及肝癌细胞增殖抑制率的相关性;分析在各药物作用下,肝癌细胞中γH2AX阳性百分数和γH2AX灶点数分别与细胞增殖抑制率的相关性.结果:4种药物作用下肝癌细胞中,γH2AX灶点数与γH2AX阳性细胞百分数呈正相关(均P＜0.05);各药物不同质量浓度分别与肝癌细胞中γH2AX阳性细胞百分数、γH2AX灶点数,以及肝癌细胞增殖抑制率呈正相关(均P＜0.01);在各药物作用下,肝癌细胞中γH2AX阳性百分数和γH2AX灶点数分别与细胞增殖抑制率呈正相关(均P＜0.05).结论:在上述4种化疗药物对肝癌细胞HepG2.215的作用中,γH2AX在细胞水平预测肝癌细胞对药物的敏感性有较高的可行性和可靠性.
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缺氧诱导因子-2α对乳腺癌细胞多药耐药的影响
目的 探讨缺氧诱导因子-2α (HIF-2α)对乳腺癌细胞多药耐药表型的影响及其意义.方法 将人低转移乳腺癌MCF-7细胞分为对照组、常氧组和缺氧组,常规培养各组细胞,采用CoCl2处理并建立细胞缺氧模型.通过实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot法检测各组细胞中HIF-2α mRNA和蛋白的表达,体外药物敏感试验检测缺氧状态下乳腺癌MCF-7细胞对化学治疗药物的敏感性;流式细胞术检测化学治疗药物在常氧组和缺氧组细胞内的蓄积、潴留及药物泵出率,并检测阿霉素诱导常氧组和缺氧组细胞的凋亡情况.结果 缺氧组人低转移乳腺癌MCF-7细胞中HIF-2α mRNA和蛋白相对表达量均高于常氧组和对照组(P＜0.05),常氧组人低转移乳腺癌MCF-7细胞中HIF-2α mRNA和蛋白相对表达量与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).缺氧组紫杉醇、阿霉素及氟尿嘧啶的半抑制浓度(IC50)显著高于常氧组(P＜0.05).与常氧组比较,缺氧组人低转移乳腺癌MCF-7细胞内阿霉素的蓄积和潴留显著降低(P＜0.05),药物泵出率显著增高(P＜0.05).阿霉素诱导下,缺氧组和常氧组人低转移乳腺癌MCF-7细胞凋亡指数分别为(68.50±0.93)％和(93.50 ±0.65)％,缺氧组人低转移乳腺癌MCF-7细胞凋亡指数低于常氧组(P＜0.05).结论 缺氧状态下HIF-2α可能通过降低化学治疗药物的潴留和蓄积、减少细胞凋亡而降低乳腺癌细胞对化学治疗药物的敏感性.
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ERCC1和Ki67表达与乳腺癌患者含铂类化疗方案敏感性的关系
目的：探讨核苷酸切除修复交叉互补基因1( ERCC1)和Ki67的表达与乳腺癌患者含铂类化学治疗(化疗)方案敏感性的关系。方法经病理学确诊乳腺癌患者129例，均行紫杉醇和卡铂联合化疗方案。吉西他滨1000 mg??( m2)－1，静脉滴注30 min，第1，8天；顺铂25 mg??( m2)－1，静脉滴注，第1~3天；21 d为1个周期，化疗6个周期。采用免疫组化分析患者肿瘤组织中ERCC1和Ki67的表达，并比较ERCC1和Ki67不同表达水平的患者对铂类化疗方案的敏感性和对铂类方案化疗患者生存的影响。结果129例患者中，ERCC1－Ki67－患者18例，临床有效率88.89％，3年累积生存率83.33％；ERCC1＋Ki67－患者24例，临床有效率50.00％，3年累积生存率62.50％；ERCC1－Ki67＋患者33例，临床有效率54.55％，3年累积生存率60.60％；ERCC1＋Ki67＋54例，临床有效率22.78％，3年累积生存率31.48％。与ERCC1－Ki67－组比较，ERCC1＋Ki67－组、ERCC1－Ki67＋组和ERCC1＋Ki67＋组患者对顺铂为基础的化疗方案的临床有效率明显下降( P<0.05)。 ERCC1＋Ki67＋组较ERCC1＋Ki67－组和ERCC1－Ki67＋组也显著下降( P<0.05)。与ERCC1＋Ki67－组和ERCC1－Ki67＋组比较，ERCC1＋Ki67＋组患者3年累积生存率明显下降(P<0.05)，而ERCC1＋Ki67－组和ERCC1－Ki67＋组比较差异无统计学意义( P>0.05)。 ERCC1＋Ki67－组和ERCC1－Ki67＋组患者3年累积生存率明显低于ERCC1－Ki67－组( P<0.05)。结论 ERCC1和Ki67在乳腺癌组织中表达水平较高，与患者铂类化疗药物的临床有效率密切相关。
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热休克蛋白70反义脱氧寡核苷酸对宫颈癌HeLa细胞生长和凋亡及化学治疗敏感性的影响
目的:探讨反义脱氧寡核苷酸封闭HSP70基因对体外宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响.方法:1)将体外培养的宫颈癌HeLa细胞分为正常对照组(Ctrl组)、反义寡核苷酸处理组(AS组)、正义寡核苷酸处理组(S组)、随机寡核苷酸处理组(R组),每组各5例,分别转染体外培养的宫颈癌HeLa细胞,采用Western免疫印迹检测各组细胞HSP70蛋白表达.2)将顺铂处理体外培养的宫颈癌HeLa细胞分为正常对照组(Ctrl组)、单纯顺铂处理组(Cis组)、反义寡核苷酸+顺铂处理组(AS +Cis组)、正义寡核苷酸+顺铂处理组(S+Cis组)、随机寡核苷酸+顺铂处理组(R +Cis组),每组各8例.采用四甲基偶氮唑蓝光吸收法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测HeLa细胞的生长抑制率；流式细胞术检测HeLa细胞的凋亡率.结果:1)Ctrl组、AS组、S组、R组HSP70灰度比值分别为1.365±0.187,0.379±0.134,1.403±0.163和1.410±0.158,转染AS组HSP70灰度比值明显下降(P＜0.01)；2)AS+Cis组生长抑制率和凋亡率明显高于其它各组,差异有统计学意义(P＜0.05),S+Cis组和R+Cis组细胞生长抑制率和凋亡率与Cis组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论:HSP70反义脱氧寡核苷酸通过下调HeLa细胞中HSP70蛋白表达,抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡.HSP70反义脱氧寡核苷酸与顺铂联合具有协同作用,能提高细胞对顺铂化学治疗的敏感性.
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高迁移率族蛋白B1对宫颈癌细胞化学治疗敏感性的影响及其机制
目的:探讨高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1,HMGB1)对宫颈癌细胞化学治疗敏感性的影响及其机制.方法:采用Western印迹法检测宫颈癌细胞HeLa和CaSki经不同药物浓度顺铂处理后LC3,Beclin1及P62的表达水平,检测使用自噬抑制剂和/或顺铂处理后宫颈癌细胞HeLa和CaSki中LC3,Beclin1及P62的表达水平;采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖水平.构建HeLa-shHMGB1,CaSkishHMGB1,HeLa-CTR及CaSki-CTR的稳定细胞系.以CCK-8检测上述细胞系顺铂半数抑制浓度(half maximum inhibitory concentration,IC50)水平;Western印迹法检测上述细胞系中HMGB1, LC3,Beclin1及P62的表达水平.结果:在一定浓度范围内,随着顺铂药物浓度的增加,宫颈癌细胞HeLa和CaSki中LC3及Beclin1的表达增加,P62表达降低.与单用顺铂组相比,顺铂联合自噬抑制剂组细胞存活率更低(P＜0.05).在宫颈癌细胞中,HMGB1的表达与顺铂药物敏感性有关(P＜0.05),与LC3,Beclin1表达呈正相关,与P62表达呈负相关.结论:HMGB1可能通过调控宫颈癌细胞内自噬的水平,影响其对顺铂的敏感性.铂类药物结合自噬抑制剂可能成为宫颈癌治疗的新策略.HMGB1可能成为预测化学治疗药物敏感性的分子标志物.
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shRNA介导GSTP1基因沉默对激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145的影响
目的:探讨谷胱甘肽巯基转移酶P1 (glutathione S-transferase P1,GSTP1)基因沉默对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145增殖活性和对化学治疗药物敏感性的影响.方法:根据选取靶序列形成短发卡状RNA(short hairpinRNA,shRNA)的DNA模板设计3条表达载体(shRNA255,shRNA554,shRNA593),并克隆到质粒pGPU6/GFP/Neo.经酶切和测序鉴定,筛选转染率高基因沉默效果好的shRNA作RNA干扰.DU145细胞株分为空白质粒转染组和shRNA转染组.转染前后按化学治疗药物分为氟尿嘧啶(fluorouracil,FU)组及紫杉醇(paclitaxel,PA)组,并按作用浓度(FU:30,60,120,240 μg/mL; PA:0.2,2,10,20μg/mL)分别分成4个亚组,并分别设有一个空白对照组.四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]比色法检测转染后细胞增殖活性的变化,MTT及末端脱氧核苷酸转移酶介导脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法(terminal de-oxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测转染前后不同浓度FU和PA对DU145细胞抑制增殖及诱导凋亡的效果.结果:3条表达载体(pGPU6/GFP/Neo-shRNA255,pGPU6/GFP/Neo-shRNA554,pGPU6/GFP/Neo-shRNA593)的转染率分别为(63.3±1.04)％,(76.2±0.68)％,(72.7±0.33)％,shRNA554转染率高,三者之间比较差异有统计学意义(P＜0.01).转染后mRNA含量分别为128.31±2.50,43.24±4.30和85.62±6.30,GSTP1蛋白含量分另为163.92±12.40,65.38±9.30和114.25±16.70,shRNA554转染后GSTP1基因mRNA和蛋白含量均低,三者比较差异有统计学意义(P＜0.01).MTT检测转染前FU不同浓度(30,60,120,240 μg/mL)四个亚组作用后细胞存活率分别为(95.60±2.11)％,(90.20±0.86)％,(83.10±3.12)％和(74.60±1.32)％；转染后存活率为(91.30±1.43)％,(84.6±2.13)％,(73.2±1.52)％和(65.5±0.94)％.TUNEL检测转染前FU不同浓度(30,60,120,240.μg/mL)四个亚组作用后细胞凋亡率分别为(5.50±0.88)％,(10.20±1.64)％,(15.20±2.39)％和(25.10±2.59)％；转染后凋亡率(10.80±0.62)％,(15.70±1.32)％,(20.40±1.89)％和(34.90±2.54)％.转染后相同FU浓度下细胞存活率降低,凋亡率增加,差异均具有统计学意义(p＜0.01).MTT检测转染前PA不同浓度(0.2,2,10,20 μg/mL)四个亚组作用后细胞存活率为(98.50±2.34)％,(95.20±1.32)％,(89.40±0.68)％和(82.70±1.73)％；转染后存活率为(94.2±0.78)％,(86.5±2.13)％,(78.7±1.34)％和(70.1±0.76)％.TUNEL检测转染前PA不同浓度(0.2,2,10,20 μg/mL)四个亚组作用后细胞凋亡率分别为(2.4±1.07)％,(5.2±1.33)％,(10.5±2.41)％和(20.7±1.92)％；转染后凋亡率(5.46±2.13)％,(13.8±1.24)％,(21.2±2.39)％和(29.2±2.21)％.转染后相同PA浓度下细胞存活率降低,凋亡率增加,差异均具有统计学意义(P＜0.01).结论:shRNA介导的GSTP1基因沉默可抑制雄激素非依赖型前列腺癌DU145细胞增殖活性,诱导凋亡,并且其作用呈现时间依赖性,可提高其对于化学治疗的药物敏感性.
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p73基因多态性与乳腺癌临床病理参数的关系
目的:研究p73基因G4C14-A4T14多态性与乳腺癌临床病理参数的关系.方法:利用Sequenom MassArray(㊣)iPLEX GOLD系统,对170例原发性乳腺癌患者进行p73基因G4C14-A4T14多态性检测,并以t检验分析不同基因型与乳腺癌患者年龄、原发灶大小的相关性；以x2检验分析不同基因型与乳腺癌临床病理参数的相关性；应用非条件logistic回归分析比较不同基因型与乳腺癌化学治疗疗效之间的关系.结果:p73基因多态性与乳腺癌患者的年龄、原发灶大小、绝经状况、TNM分期、病理类型、腋窝淋巴结转移、雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体2以及p53均无明显相关性(P＞0.05)；三阴性乳腺癌(雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2均阴性)中GC/GC基因型频率明显高于非三阴性乳腺癌(78.9％ vs 57.6％,x2=5.741,P=0.017); p73基因多态性与乳腺癌对蒽环类药物的化学治疗敏感性无明显关系(P＞0.05).结论:p73基因G4C14-A4T14多态性与三阴性乳腺癌显著相关,携带GC/GC基因型的乳腺癌患者可能预后不良.
