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转基因细胞模型L02/HBx的构建及HBx对细胞周期的影响
目的:构建L02/HBx转基因细胞模型并研究HBx对肝细胞周期的影响.方法:运用脂质体转染和G418筛选获得L02/HBx阳性克隆,并分别用RT-PCR和Westernblot鉴定HBx mRNA与蛋白的表达.进一步用四唑蓝(MTT)比色试验、流式细胞仪检测L02/HBx的增殖、凋亡和细胞周期.结果:RT-PCR和Western blot分别检测到L02/HBx细胞中HBx mRNA和蛋白的表达.MTT比色试验显示L02/HBx生长速度加快,流式细胞仪检测发现L02/HBx凋亡率低(0.09%±0.13%vs 3.74%±1.29%,P＜0.05),G1期细胞比例减少(61.35%±0.82% vs 67.80±6.84%,P＜0.05),S期细胞比例相应增加(36.59%±2.54% vs 22.37%±2.17%,P＜0.05).经阿霉素(ADM)培养后,L02/HBx的凋亡率显著增加(34.91%±5.85% vs 0.09%±0.13%,P＜0.05),G1期细胞比例明显增加但低于对照组(82.81%±6.48%vs 61.35%±0.82%,P＜0.05;82.81%±6.48%vs 87.19%±1.92%,P＜0.05),S期细胞比例降低但较对照组高(13.84%±6.16% vs 36.59%±2.54%,P＜0.05;13.84%±6.16% vs 2.22%±1.26%,P＜0.05).结论:L02/HBx构建成功,HBx能促进细胞周期进程,加快细胞的生长并抑制细胞的凋亡;转染HBx基因的肝细胞凋亡更易受凋亡因子所触发,表明HBx可能会增加正常肝细胞对诱导凋亡因素的敏感性.
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HBx蛋白及其羧基末端缺失35个氨基酸的突变体对正常肝细胞增殖的影响
目的 构建野生型HBx(wild-type HBx, wt-HBx)和自然突变体HBx(truncated HBx, tHBx△35)重组慢病毒表达载体,建立稳定转染细胞株,观察wt-HBx和tHBx△35对肝细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建TOPO3.1- wt-HBx和TOPO3.1-tHBx△35重组慢病毒载体;与3个质粒包装系统用磷酸钙方法 共同转染到人293T细胞,包装成病毒颗粒,分别感染肝细胞L02和MIHA,并进行荧光和Western blot法检验细胞中wt-HBx和tHBx△35的表达情况.用细胞计数,细胞活力测定,集落形成实验,流式细胞仪等方法 检测对肝细胞增殖和凋亡效应的影响.结果 重组慢病毒载体及稳定转染细胞株构建成功,转染后wt-HBx和tHBx△35在细胞中表达明显变化; tHBx△35过表达细胞的增殖速度明显高于wt-HBx组和CTRL对照组,而感染wt-HBx组的肝细胞增殖速度比CTRL对照组和tHBx△35组增殖速度慢 (P＜0.05); tHBx△35可能通过促进细胞S期的合成而刺激细胞增殖,而wt-HBx可能通过捕获细胞的GO/G1期而抑制细胞增殖.但tHBx△35, wt-HBx在肝细胞的凋亡率是很低的.结论 HBx对肝细胞具有抑制增殖的作用,而tHBx△35对肝细胞具有促进增殖的作用.
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HBx基因在乙型肝炎病毒相关性肾炎致病机制中的研究进展
HBx基因是一种多功能的调节因子,具有广泛的反式激活作用,能激活转录因子、抑制DNA修复,并调节细胞的增殖、转化及凋亡.近年来,HBx在乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)致病中的作用成为研究的热点.研究显示,HBx对肾小球系膜细胞增殖、足细胞及肾小管上皮细胞的损伤及凋亡存在广泛影响.此文就HBx的生物学特性及在肾脏损伤机制中的研究进展进行了综述.
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HBx基因大鼠卵圆细胞株的建立及鉴定
目的 构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达质粒pEGF-HBx,建市稳定、高效表达乙型肝炎病毒x基因(HBx)的大鼠卵圆细胞株,以便进一步研究HBx基因和卵圆细胞在肝癌发牛过程中的作用和机制.方法 用PCR方法从质粒pcDNA3.1-HBx中扩增含Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的HBx基因序列.对增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-NI)及扩增的HBx目的 基因片段进行双酶切,纯化后用连接酶连接得到重组体pEGFP-HBx,将其转化大肠杆菌DHSα,抗生素筛选培养得到阳性克降,提取质粒后用双酶切和基因测序进行鉴定.通过脂质体介导将质粒pEGFP-HBx转染到大鼠卵圆细胞株(LE/6)中,经G418筛选,尤限传代后得到稳定表达EGFP-HBx融合蛋白的细胞株.分别采用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测细胞株中HBx基凶的表达情况.结果 双酶切及基因测序结果均显示构建的pEGFP-HBx质粒中含有完整的HBx基因片段.将得到的抗性细胞株培养传代20次后仍表达强的荧光;RT-PCR及免疫细胞化学检测均发现HBx基因在抗性细胞(LE/6)中得到了稳定转录和翻译.结论 已成功构建带HBx基因的真核表达质粒pEGFP-HBx,获得了稳定、高效表达EGFP-HBx融合蛋白的大鼠卵圆细胞株,为进一步研究HBx基凶和卵圆细胞在肝癌发生过程中的作用和机制奠定了实验基础.
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HBx基因稳定转染对SUDHL-4细胞增殖和转移影响
目的 临床上发现许多恶性淋巴瘤患者伴有乙型肝炎病毒的感染,两者的关系日益受到关注.本研究旨在研究HBx基因稳定转柒对淋巴瘤细胞SUDHL-4增殖和转移的影响.方法 利用脂质体转染法将pcDNA3.1-x转入SUDHL-4细胞中,经G418筛选出稳定表达HBx的细胞株SUDHL-4-HBx,以SUDHL-4及转染空载体的细胞SUDHL-4-con作对照,采用细胞计数盒8(cell counting kit 8,CCK8)法检测各组细胞24、48、72和96 h的增殖活性;利用流式细胞仪检测3组细胞的细胞周期和凋亡变化情况;采用改良四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞黏附力;用Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭力.结果 将HBx转入SUDHL-4细胞中,经筛选的SUDHL-4-HBx细胞有HBx mRNA及蛋白质的表达.细胞增殖实验结果显示,稳定构建的SUDHL-4-HBx细胞株24、48、72和96 h吸光度(A)值分别为0.36±0.011、0.76±0.009、1.55±0.042和1.58±0.057,对照组SUDHL-4细胞24、48、72和96 h的A值分别为0.29±0.003、0.46±0.126、0.84±0.026和0.90±0.015,SUDHL-4-con细胞24、48、72和96 h的A值分别为0.22±0.001、0.38±0.008、0.83±0.035和1.01±0.054.稳定构建的SUDHL-4-HBx细胞株相比于对照组SUDHL-4细胞和SUDHL-4-con细胞48 h后增殖显著加快,HBx与时间之间存在协同的交互作用,P＜0.05.细胞周期无明显变化.SUDHL-4、SUDHL-4-con和SUDHL-4-HBx组细胞的凋亡率分别为(14.9±0.18)％、(i0.1±0.31)％和(4.8±0.26)％,SUDHL-4-HBx组细胞凋亡明显减少,与其他两组比较差异有统计学意义,P＜0.05.改良MTT法测得SUDHL-4组、SUDHL-4-con组和SUDHL-4-HBx组细胞的黏附力分别为0.70±0.14、0.63±0.21和1.23±0.43,与其他两组相比,SUDHL-4-HBx组细胞的黏附力显著增加,P＜0.05.Transwell小室实验结果显示,SUDHL-4和SUDHL-4-con组迁移细胞数分别为(58±4)个/400倍视野和(56±5)个/400倍视野,SUDHL-4-HBx组迁移细胞数为(73±5)个/400倍视野,与对照组相比显著增加,P＜0.05;SUDHL-4、SUDHL-4-con和SUDHL-4-HBx组侵袭细胞数分别为(64±5)个/400倍视野、(63±6)个/400倍视野和(81±5)个/400倍视野,SUDHL-4-HBx组细胞侵袭能力显著增加,P＜0.05.结论 成功构建稳定转染HBx的淋巴瘤细胞SUDHL-4-HBx,HBx的稳定表达可抑制人淋巴瘤细胞SUDHL-4的凋亡,促进细胞增殖,提高细胞的黏附、迁移、侵袭能力.
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截断型突变体HBx-Mut120稳定表达真核细胞系的建立
目的 成功构建HBx及其截断型突变体HBx-Mut120的真核载体,建立了两者稳定表达的HepG2细胞系,并研究了目的基因对细胞生长的影响.方法 采用PCR扩增HBx及其截断型突变体HBx-Mut120基因,然后分别克隆到PCMV-Tag2B载体中,并构建成重组质粒HBx-PCMV-Tag2B和HBx-Mut120-PCMV-Tag2B,经过PCR、酶切、测序鉴定重组质粒后,将其转染人肝癌细胞HepG2,经Game 418筛选后得到稳定表达目的基因的HepG2细胞,后通过RT-PCR和Wcsternblot鉴定HBx、HBx-Mut120的mRNA和蛋白在HepG2细胞中的表达情况,并用流式细胞仪检测了各组细胞的周期.结果 (1)成功构建目的基因表达载体PCMV-Tag2B-HBx、PCMV-Tag2B-HBx-Mut120.(2)成功建立稳定表达HBx及其缺失片段的HBx蛋白的HepG2细胞系.(3)通过流式细胞仪检测各组细胞周期及对比,发现HepG2-HBx细胞和HepG2-HBx-Mut120细胞的生长分数(G2+S)明显高于HepG2细胞及空载体转染的HepG2细胞.结论 本实验成功构建携带HBx及其截断型突变体HBxMut120基因的重组表达质粒,转染人肝癌细胞HepG2细胞后分别能够稳定表达HBx蛋白和截断型HBx蛋白,HBx及其突变体稳转细胞后更能促进HepG2细胞的增殖,且突变型目的基因稳转细胞系转移能力较前明显增强.为进一步研究截断型HBx突变体在肝癌的发生、发展中的作用奠定了实验基础.
关键词： HBx基因 HBx蛋白 C端截短型HBx突变体 HepG2细胞 -
HBx基因促进原发性肝癌侵袭与转移的分子机制
原发性肝癌与乙肝病毒感染密切相关.当前发现HBx基因编码产物x蛋白是HBV中惟一具有多种调控功能的病毒蛋白质,HBx通过改变细胞与ECM间黏附机制等机制促进肝癌细胞的侵袭与转移,现将相关文献进行总结,为防治原发性肝癌转移复发提供新的探索方向.
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HBx基因通过调节凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值促进人肾小管上皮细胞凋亡
目的 探讨HBV x基因(HBx)对人肾小管上皮细胞株(HK-2)增殖和凋亡的影响及机制.方法 采用脂质体转染法,将质粒pCDNA3.1 (+)HBx转染至HK-2细胞株.细胞实验分5组,对照组、转染空质粒pCDNA3.1(+)组、转染pCDNA3.1 (+)HBx24 h组、转染pCDNA3.1 (+)HBx 48 h组、转染pCDNA3.1(+)HBx 72 h组.CCK8方法检测HBx对各组细胞增殖抑制率的影响;用透射电镜及AV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率.应用免疫细胞化学及免疫印迹检测各组细胞凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2水平.结果 经酶切鉴定及测序结果显示pCDNA3.1-HBx构建成功.与对照组相比,空质粒组细胞存活率及凋亡率无明显差异,凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值无明显差异(P＞0.05).转染HBx基因24 h后,细胞增殖明显受抑,凋亡率显著增加,Bax/Bcl-2比值开始增高.至72 h,细胞增殖抑制率高达到(35.27±1.10)％,细胞凋亡率达到高为(23.80±2.16)％,Bax/Bcl-2比值显著增高.与对照组及其他各组比较,具有显著性差异(P＜0.05).结论 HBx基因可抑制HK-2细胞增殖并通过提高凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值诱导其凋亡.
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人HBV、HBx定向敲入p53位点大鼠胚胎干细胞株的建立
目的 建立人HBV、HBx定向敲入p53位点的大鼠胚胎干细胞株,为建立相关动物模型奠定基础.方法 通过PCR方法扩增出人p53基因上下游同源臂、HBV全基因组序列、HBV的X蛋白编码基因(HBx),将其插入本实验室自主构建的基因打靶通用载体pKO中,分别构建pKO-gHBV及pKO-X打靶载体.载体经SalⅠ酶切线性化后,电转入状态良好的大鼠胚胎干细胞株中,经3轮药物筛选,获得单细胞克隆.通过PCR技术筛选获得阳性细胞克隆,并进行支原体污染鉴定和核型分析.结果 成功构建pKO-gHBV及pKO-X打靶载体；电转大鼠胚胎干细胞株,经3轮药物筛选,分别挑取若干细胞克隆,其中2个pKO-X细胞克隆和1个pKO-gHBV细胞克隆经PCR鉴定、支原体检测和核型分析确定结果正确.结论 成功建立了人HBV、HBx定向敲入p53位点的大鼠胚胎干细胞株,为后续建立动物模型奠定了基础.
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乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育
目的:建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因(adr亚型)转基因小鼠模型,以研究x基因的功能.方法:采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因(adr亚型)开放阅读框(ORF)的真核表达载体pcDNA3-HBx.该载体经SalⅠ限制性内切酶线性化后,琼脂糖电泳回收目的片段,用原核显微注射法将其注射入雄原核,制备转基因小鼠.复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder;免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况.结果:成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx.经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后,出生并存活了11只新生鼠,经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠,命名为C57-TgN(HBx)SMMU.免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达.将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配,进行传代培育,复合PCR法筛选阳性转基因小鼠,目前已传至F4代.结论:本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57-TgN(HBx)SMMU,它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用.
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乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建
目的 为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体.方法 应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3.l-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,得到pAdTrack-CMV-HBx,将其PmeⅠ酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd-HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad-HBx.结果 PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad-HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP.结论 成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础.
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肝细胞癌组织中HBx基因蛋白表达与凋亡关系
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发生的主要病因之一,HBx基因具有癌基因的特性,其表达产物HBx蛋白具有转录激活子功能,在HCC的发生发展中起着重要的作用[1,2].研究HBx蛋白的表达及其对细胞凋亡的调节有助于阐述HCC的发生发展机制.笔者利用S-P免疫组化方法和原位脱氧核糖核酸末端转移酶(in situ terminal deoxyribonucleotide transferase, ISTdT)标记技术分别检测HCC组织中HBx蛋白表达和细胞凋亡,旨在探讨二者与HCC发生发展的关系及作用.
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乙型肝炎病毒X蛋白上调肝癌多药耐药相关基因表达的研究
目的研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)对肝癌耐药相关基因MDRI,MRP1,MRP23,MRP3,LRP的影响从而探讨HBX基因影响肝癌多药耐药性状的分子机制.方法应用脂质体介导技术对人肝癌细胞株HepG2瞬时转染HBX基因,然后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot技术分别检测转染后多药耐药相关基因和蛋白水平的表达情况.再使用MTT检测阿霉素及丝裂霉素诱导后细胞存活率的变化.结果转染前后相比,转染HBX基因的HepG2细胞多药耐药相关基因和蛋白表达水平比转染前均明显上调(P＜0.05)转染后PRP1基因表达量与转染前比为3.11,PRP2为1.69,LRP3为1.46,MDR1为3.64,LRP为1.90.Westernblot显示转染后LDR1蛋白水平上升1.10倍,MRP1蛋白上升1.28倍,LRP蛋白上升1.08倍.MTT结果显示阿霉素和丝裂霉素IC50转染组明显高于对照组.结论乙型肝炎病毒X蛋白可能促进肝癌多药耐药的产生.
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HBx基因瞬时转染对 SUDHL-4细胞增殖的影响
目的：研究HBx基因瞬时转染对淋巴瘤细胞SUDHL-4增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法：用分子克隆方法构建HBx基因的真核载体pcDNA3．1-X，利用脂质体转染法将pcDNA3．1-X转入淋巴瘤细胞SUDHL-4中，构建整合有HBx基因的淋巴瘤细胞株SUDHL-4-HBx，以SUDHL-4及转染空载体的细胞SUDHL-4-con作为对照，利用CCK8法检测细胞转染24、48、72和96 h后的增殖活性，绘制生长曲线；应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况。结果：重组质粒双酶切结果及测序结果表明成功构建pcDNA3．1-X，转染后SUDHL-4细胞有HBx mRNA及蛋白的表达。与SUDHL-4组及SUDHL-4-con组相比，SUDHL-4-HBx组细胞的增殖能力下降，G0／G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少，凋亡率升高（P＜0．05）。结论：瞬时转染HBx基因后，SUDHL-4细胞增殖减缓，细胞周期阻滞于G0／G1期，凋亡率增加。
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重组表达乙肝病毒x蛋白的腺病毒构建及在HepG2细胞的表达
目的:构建重组表达HBx的腺病毒,并通过感染细胞建立HBx高表达的细胞模型.方法:首先将HBx基因插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack 中,限制性酶切鉴定正确后将其用PmeⅠ酶切线性化,转到BJ5183感受态细菌进行同源重组,重组后的腺病毒载体pAd-HBx经PacⅠ酶切线性化后,转染到QBI-293A细胞中,根据EGFP的表达判断重组腺病毒的包装情况.RT-PCR鉴定重组腺病毒的HBx基因表达.根据GFP的表达检测病毒滴度和感染效率.将病毒感染人肝癌HepG2细胞,48 h后收集裂解细胞,Western blot检测HBx蛋白的表达.结果:重组腺病毒载体pAd-HBx经酶切鉴定确认构建成功.将pAd-HBx转染到QBI-293A细胞,荧光检测提示病毒获得成功包装,RT-PCR检测到细胞中HBx基因的表达.重组病毒感染人肝癌HepG2细胞,Western blot检测到HBx蛋白表达.结论:成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒,感染肝癌HepG2细胞后检测到了HBx蛋白的表达,提示建立了HBx高表达的细胞模型,为后续的HBx的功能研究奠定了基础.
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乙型肝炎病毒x基因上调肝癌细胞胰岛素样生长因子-Ⅱ胚胎启动子活性的研究
目的 研究乙型肝炎病毒x基因（HBx）对肝癌细胞胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)启动子活性的影响，探讨HBx基因影响肝癌恶性表型的分子机制。方法 应用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测QGY7701肝癌细胞株和转HBx基因肝癌细胞株QGY/HBx的IG F-Ⅱ成年启动子P1与胚胎启动子P3、P4的活性。结果 与QGY7701 细胞相比，QGY/HBx细胞IGF-Ⅱ基因P1启动子活性无明显改变(分别为3.12±1.18与3.7 4±1.87，P＞0.05)，而P3与P4活性显著升高(2.27±0.68、3.97±1.66与1.20±0.39、 1.45±0.43比较，P＜0.05)。结论 HBx基因可上调肝癌细胞 IGF-Ⅱ基因胚胎启动子P3、P4活性，这可能HBx基因增强肝癌恶性表型的一个重要机制。
关键词： 肝肿瘤 HBx基因 胰岛素样生长因子-Ⅱ 启动子 -
乙型肝炎病毒x蛋白与肝癌多药耐药性的初步探讨
目的:研究乙型肝炎病毒x蛋白(HBX)对肝癌耐药相关基因MDR1、MRP1的作用及其影响.方法:利用瞬时转染HBX基因的方法建立细胞模型,然后用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹检测(Westernblot)技术,分别检测转染前后人癌肝细胞株HepG2多药耐药相关基因和蛋白水平的表达情况.再使用流式检测阿毒素诱导后两种细胞的凋亡率.结果:转染前后相比,转染HBX基因的HepG2细胞多药耐药相关基因和蛋白表达水平比转染前均明显上调(P＜0.05);转染后MPR1基因表达量与转染前比为3.11,MDR1为4.99.Western bl0t显示转染后p-170蛋白水平上升1.10倍,MRP蛋白上升5.08倍.AnnexinV-FITC/PI检测提示,阿霉素诱导后转染组调亡率明显低于对照组.结论:乙型肝炎病毒x蛋白可能是造成肝癌多药耐药的原因之一.
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HBx基因下调miR-192对人肝癌细胞株HepG2周期的影响
目的 探讨HBx基因通过调节miR-192的表达影响人肝癌细胞株HepG2周期进展的机制.方法 流式细胞仪分析以下3组细胞的周期变化:HepG2/HBx细胞(HepG2细胞稳定转染HBx基因)、HepG2/pcDNA3.1细胞(HepG2细胞稳定转染空载体pcDNA3.1)以及HepG2细胞.3组细胞中miR-192的表达采用Taqman探针荧光定量PCR法检测.流式细胞术观察转染miR-192后HepG2细胞的周期分布变化,SYBR Green荧光定量PCR和Western blot分别检测miR-192对HepG2细胞p53、CDKN1A mRNA和蛋白表达的影响.结果 3组细胞中,HepG2/HBx细胞G0/G1期细胞比例明显降低[(52.78±4.08)% vs(67.37±4.87)%,(65.08±5.15)%],S期和G2/M期比例明显升高[S期:(25.22±1.84)% vs(19.78±1.26)%,(18.84±1.68)%;G2/M期:(22.00±2.07)% vs(12.85±1.29)%,(16.08±1.44)%].HepG2/HBx细胞miR-192表达显著下调[(49.1±5.9)% vs(98.0±8.9)%,(100.0±9.1)%].转染miR-192引起HepG2细胞G0/G1期和G2/M期阻滞,同时p53、CDKN1A mRNA(p53:1.68±0.12 vs 0.90±0.06;CDKN1A:2.36±0.12 vs 1.05±0.06)和蛋白(p53:3.07倍;CDKN1A:2.82倍)的表达水平亦显著上升.结论 miR-192通过促进p53和CDKN1A表达引起HepG2细胞周期阻滞,而HBx通过下调miR-192加速HepG2细胞周期进程.
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Ad-HBx的构建及在肾小球足细胞系的表达
目的 构建携带HBx基因的非复制型重组腺病毒载体,并感染小鼠肾小球足细胞株MPC5,使目的 基因HBx在该细胞株有效表达.方法 由质粒PCI-neo-HBx中扩增目的 基因HBx.插入至pShuttle-CMV(-)穿梭质粒中,而后再与pAdxsi质粒酶切连接为重组腺病毒质粒pAd-HBx,经酶切及测序鉴定正确后,以Pac Ⅰ酶切线性化转染293细胞进行包装扩增得到Ad-HBx.以Ad-HBx感染MPC5细胞,Western blot检测感染后目的 蛋白HBx的表达.结果 重组腺病毒载体经限制性内切酶酶切、电泳和基因测序鉴定,证实Ad-HBx构建成功;当MOI=50时.MPC5细胞即可100%被重组腺病毒感染,且持续至感染后72 h仍有较强水平的表达;感染Ad-HBx的MPC5细胞可稳定表达HBx蛋白.结论 成功构建了Ad-HBx,并能在MPC5细胞中稳定表达,为进一步研究HBx基因在乙型肝炎病毒相关性肾炎发病中的作用奠定了基础.
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RNA干扰HBx基因对肝癌细胞化疗效果的影响
目的:探讨RNA干扰技术和传统的化疗方法联合应用对肝癌细胞生长抑制作用的影响,并选择高效的治疗组合,研究其凋亡机制.方法:鉴定3组肝癌细胞--MHCC97-H(原肝癌细胞株),HK3细胞(转染空质粒的MHCC97-H细胞)和21543细胞(转染含HBx-shRNA质粒的MHCC97-H细胞);RT-PCR检测RNA干扰对HBx mRNA沉寂作用,CCK8和TUNEL分别检测RNA干扰HBx后化疗药物对MHCC97-H肿瘤细胞生长的抑制及诱导细胞凋亡情况.结果:RT-PCR结果显示,与MHCC97-H细胞组比较,21543细胞的HBx mRNA水平下降约91%,HK3细胞HBx mRNA水平下降不明显;RNA靶向干扰HBx基因后的肝癌细胞(21543细胞)较原肝癌细胞(MHCC97-H细胞)和HK3细胞增殖明显减慢,而后两种细胞差别无统计学意义;3种不同细胞加用3种不同浓度的氟尿嘧啶(0～120 mg/L)、顺铂(0～32 mg/L)后细胞生长明显减慢并呈浓度依赖性,以RNA靶向干扰HBx基因后的21543细胞生长抑制明显;相同浓度的氟尿嘧啶对3组不同肝癌细胞均可引起细胞凋亡,以21543细胞凋亡明显.结论:RNA干扰HBx可明显抑制肝癌细胞的增殖,并增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性;RNA干扰HBx基因和化疗药物联合应用使肝癌细胞凋亡更明显,细胞增殖速度明显减慢.
