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采用罗氏培养基进行MTB药物敏感性试验的影响因素分析
目的 评价基于罗氏培养基绝对浓度法的结核分枝杆菌药物敏感性试验(简称"药敏试验")检测异烟肼、利福平、乙胺丁醇的药物浓度标准,以及不同接种菌量、接种方式对耐药性检测结果的影响.方法 按照世界卫生组织推荐方法从可能敏感患者和可能耐药患者痰液样本中的分离菌株,分别测定两类菌株对异烟肼、利福平、乙胺丁醇的低抑菌浓度(MIC)并计算累计百分比,以两类菌株累计百分比差值大的MIC确定耐药界限;分别将菌量为10-3 mg和10-4 mg的结核分枝杆菌,接种于比例法耐药界限的3种药物含药培养基,经4周孵育后比较耐药结果;比较接种量均为10-6 mg菌量的两种接种方法(接种环和滴管接种)孵育4周后菌落形成单位(CFU)的数量差异. 结果 异烟肼、利福平和乙胺丁醇经绝对浓度法测定的浓度界限分别为0.2 μg/ml、40 μg/ml、2 μg/ml;不同接种量(10-3 mg与10-4 mg)接种相同含药培养基,其药敏试验结果差异无统计学意义(χ2值分别为0.57、0.00、0.00,P值分别为0.45、1.00、1.00);使用接种环接种菌悬液的菌落形成单位数[(40.60±34.54)个,95%CI=35.08~46.12个]明显多于使用滴管的菌落形成单位数[(11.27±11.11)个,95%CI=9.50~13.05个](t=11.58,P<0.01). 结论 异烟肼、利福平、乙胺丁醇的耐药界限采用比例法药物浓度界限更适宜;接种菌量10-3 mg和10-4 mg对药敏试验结果无明显影响;接种环接种效果较滴管接种效果好.
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成人食管上皮细胞的体外培养及生物学特性
目的 培养成人正常食管上皮细胞,建立能够体外长期培养的食管上皮细胞系,为上皮细胞的体外研究提供实验材料.方法 取食管癌患者正常食管上皮,用0.25%Dispase酶和0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化获取成人食管上皮细胞,使用无血清角化细胞培养液培养,通过细胞形态学观察和角蛋白、上皮膜抗原(EMA)免疫组织化学染色鉴定细胞.结果 原代培养8d后,细胞汇合成片呈铺路石样生长,细胞角蛋白、上皮膜抗原表达阳性,可连续传代.结论 为体外分离培养成人正常食管上皮细胞建立了方便可行的方法.
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神经匀浆激活的巨噬细胞条件培养基对鸡胚背根节神经突起生长的影响
为探讨巨噬细胞在神经再生中的作用机制,本研究用溃变的神经匀浆激活巨噬细胞,将该巨噬细胞条件培养基作用于神经细胞,以观察溃变神经能否激活和诱导巨噬细胞参与神经再生.切取预溃变1d的大鼠自体坐骨神经并放入无血清DME/F12培养基中磨成匀浆,然后注回大鼠腹腔.
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无血清免疫学标志的乙肝病毒株分子生物学特性
随着聚合酶链反应法(PCR)技术广泛用于扩增血清和肝脏组织中的乙型肝炎病毒(HBV)DNA，现已发现一些乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性的HBV变异株[1]，人感染这些HBV变异株后，无血清HBV标记，从而给诊断、治疗和预防带来困难，目前对这些变异株在HBV携带者中所占比例及其致病性尚未充分了解。因此，研究其分子生物学特性具有重要意义。本文报道一例无血清免疫学标志的原发性肝癌患者HBv变异株的分子生物学特性。
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人骨肉瘤细胞系HOS肿瘤干细胞样细胞亚群的分离与鉴定
目的：探索无血清培养基培养人骨肉瘤细胞系 HOS 细胞，筛选并鉴定人骨肉瘤细胞系HOS中肿瘤干细胞相关亚群。方法通过无血清悬浮培养初步富集骨肉瘤细HOS肿瘤干细胞，观察其形成肿瘤干细胞球过程中的细胞形态，并在有血清培养基中诱导其分化。各种浓度化疗药物顺铂（CDDP）和阿霉素（DXR）分别处理HOS悬浮细胞球与HOS贴壁细胞，MTT法检测两种细胞对化疗药敏感性。Real-time PCR检测HOS悬浮细胞球与HOS贴壁细胞干细胞相关基因ABCG2、Bmi1、Nanog、Oct3/4、Sox10、STAT3表达情况。将HOS悬浮细胞球与HOS贴壁细胞分别接种于BALB/c裸鼠，观察成瘤情况。结果人骨肉瘤细胞系HOS细胞能够在无血清培养基中存活、增殖并形成肿瘤干细胞球。HOS悬浮细胞球对于化疗药物的敏感性较HOS贴壁细胞高。Real-time PCR结果显示 HOS 悬浮细胞球较 HOS 贴壁细胞高表达肿瘤干细胞相关基因 ABCG2、Bmi1、Nanog、Oct3/4、Sox10、STAT3。HOS悬浮细胞球体内成瘤能力较HOS贴壁细胞强。结论无血清悬浮培养可以初步富集人骨肉瘤细胞系HOS悬浮细胞球，且这些细胞具有肿瘤干细胞特性。
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大鼠骨髓基质干细胞分化为胰岛样细胞
目的:探讨体外自体骨髓基质干细胞(MSC)定向诱导分化为胰岛样细胞的可能性,为进一步诱导分化胰岛细胞治疗糖尿病奠定实验和理论基础.方法:对Wistar大鼠骨髓基质干细胞(MSC)进行体外培养,通过不同的条件诱导MSC向胰岛样细胞分化:LN组,10 mmoL/L尼克酰胺+1 mmoL/L β-巯基乙醇的L-DMEM(含20 mL/L FBS)预先诱导24 h,10 mmoL/L尼克酰胺+1mmol/L β-巯基乙醇的无血清H-DMEM诱导10 h.HN组,含20 mmoL/L尼克酰胺的L-DMEM(20 mL/L FBS)预先诱导24 h,20 mmoL/L尼克酰胺的无血清H-DMEM诱导10 h.诱导细胞形态通过倒置显微镜观察,并通过免疫细胞化学检测分化细胞表达Insulin和Nestin.向3只Streptozotocin(STZ)诱导糖尿病大鼠皮下种植MSC分化胰岛细胞1×107,1 wk后观察大鼠血糖水平变化.结果:LN、HN组细胞均可见部分骨髓基质干细胞分化、增生,形成胰岛样细胞团,部分细胞向神经元样细胞分化,对照组细胞未见明显分化.免疫细胞化学显示Insulin在诱导细胞呈显著表达,Nestin在分化前细胞显著表达.皮下种植MSC分化胰岛细胞可有效降低STZ糖尿病大鼠的血糖水平.结论:体外诱导骨髓基质干细胞定向分化为胰岛样细胞存在可行性,本实验将可能为临床糖尿病干细胞治疗提供新的途径.
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胚胎干细胞诱生的胰岛素分泌细胞分泌胰岛素的研究
目的:研究小鼠胚胎干细胞ES-D3诱生的胰岛素分泌细胞(IPCs)分泌胰岛素的能力及其所分泌的胰岛素的活性.方法:将ES-D3细胞培养于经处理的鼠胚成纤维细胞滋养层上保持未分化状态扩增,对数生长期时转入无血清含bFGF的DMEM液进行诱导,隔天换液,21 d后,采用DTZ染色、免疫细胞化学染色和ELISA等方法检测胰岛素的生成与分泌情况;用RT-PCR法检测PDX-1、Insulinl、Insulin2和Glut2等胰岛素分泌细胞相关基因mRNA的表达,并通过动物实验研究生成的IPCs所分泌的胰岛素的降糖活性.结果:在诱导21 d,DTZ染色法观察到被DTZ染成洋红色的IPCs;免疫细胞化学染色法显示诱导体系中有胰岛素特异性免疫反应阳性的细胞群;ELISA法测定结果表明IPCs受高糖刺激后分泌胰岛素,动物实验证明所分泌的胰岛素具有降糖活性;RT-PCR法检测到有Insulin2和PDX-1 mRNA的表达,Insulinl呈弱表达,Glut2不表达.结论:小鼠胚胎干细胞ES-D3诱生的IPCs能够合成并分泌胰岛素,而且分泌的胰岛素具有降糖活性.
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胰腺癌肿瘤干细胞的悬浮培养法
目的 建立无血清悬浮培养分离人胰腺癌细胞系PANC1干细胞球的方法.方法 采用无血清悬浮法培养PANC1细胞,显微镜下观察干细胞球形成率;流式细胞仪检测细胞CD133表达和细胞周期;以含10%FBS培养基诱导干细胞球细胞分化,荧光显微镜下观察细胞形态及CK18的表达;干细胞球细胞接种NOD/SCID小鼠皮下,观察其成瘤能力.结果 在无血清悬浮培养条件下存活的PANC1细胞形成干细胞球,体外连续传代培养20代始终保持4%0～5%0的干细胞球形成率.干细胞球细胞CD133表达率(5.91±0.7)%,G0/G1期细胞占(80.99±2.60)%,与原代PANC1细胞的(1.44±0.52)%和(69.01±5.03)%相差显著(P＜0.05).将于细胞球细胞置含血清培养基中培养.细胞逐渐恢复原代细胞形态,并表达上皮标志蛋白CK18,2×103的干细胞即在NOD/SCID小鼠皮下成瘤.结论 无血清悬浮法培养PANC1细胞可分离出肿瘤干细胞,其具有自我更新、多向分化和成瘤能力.
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无血清培养骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化条件的优化
目的:探索无血清培养的骨髓基质干细胞(BMSCs)向神经细胞诱导分化条件的优化方案,为BMSCs应用于脊髓损伤的临床治疗创造条件.方法:用含2% Utroser G的UltraCULTURE无血清培养体系体外扩增人BMSCs,采用流式细胞仪检测培养细胞的表面标志,再以全反式维甲酸、β-巯基乙醇和神经生长因子为主要成分组成6种诱导液诱导BMSCs向神经细胞分化,镜下观察细胞形态学变化,用抗人β微管蛋白(β-Tubulin)抗体和抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体进行免疫荧光染色鉴定诱导后的神经细胞,通过流式细胞仪检测诱导后细胞的凋亡率.结果:无血清培养的BMSCs在6种诱导条件下均可不同程度地分化为神经样细胞,镜下可见诱导后细胞表现为神经细胞形态特征,免疫荧光染色显示β-Tubulin和GFAP均有阳性表达,诱导后细胞发生不同程度的凋亡,其中全反式维甲酸和神经生长因子组成的复合诱导液的诱导效率较高,诱导后细胞凋亡率较低.结论:全反式维甲酸与神经生长因子联合应用可在体外高效、稳定地诱导无血清培养的BMSCs分化为神经样细胞,是较佳的诱导条件.
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人肝癌干细胞生物学行为的实验研究
目的：探讨人肝癌干细胞的生物学行为。方法取对数生长期的人肝癌 MHCC97H细胞接种至无血清培养基悬浮培养,获得稳定传代的人肝癌 MHCC97H 干细胞。分别取人肝癌MHCC97H 干细胞微球和人肝癌 MHCC97H 细胞,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞标志物分化群(CD)133、CD90、上皮细胞黏附分子(EpCAM)信使核糖核酸(mRNA)。分别进行克隆形成实验、肿瘤细胞侵袭实验(Transwell实验)、裸鼠成瘤实验观察两种细胞克隆形成、侵袭性及成瘤情况。两种细胞实验数据比较采用 t 或 t′检验。结果人肝癌 MHCC97H 干细胞 CD133、CD90、EpCAM mRNA 含量分别为32.70±0.20、66.30±0.32、115.40±4.00,人肝癌 MHCC97H 细胞分别为1.27±0.29、13.60±1.36、1.34±0.40,人肝癌 MHCC97H 干细胞 CD133、CD90、EpCAM mRNA平均含量明显高于人肝癌MHCC97H细胞(t′=117.8,53.97,83.37；P<0.05)。人肝癌MHCC97H干细胞的克隆形成率为(213±10)%,人肝癌MHCC97H细胞为(54±11)%,差异有统计学意义(t=13.11, P<0.05)。通过Transwell 实验发现,人肝癌MHCC97H干细胞穿膜细胞数为(587±120)个/视野,人肝癌 MHCC97H细胞为(97±13)个/视野,差异有统计学意义(t=6.38, P<0.05)。在裸鼠成瘤实验中,接种2×103个人肝癌MHCC97H干细胞的裸鼠4周可形成皮下移植瘤,成瘤率1/6；2×105个人肝癌MHCC97H干细胞可使全部裸鼠形成皮下移植瘤,成瘤率6/6；至少需要2×105个人肝癌 MHCC97H 细胞裸鼠才能形成皮下移植瘤,成瘤率2/6。结论与人肝癌MHCC97H细胞相比,人肝癌MHCC97H干细胞具有更强的侵袭性和更高的成瘤率。
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滑液间充质干细胞在无血清培养条件下生物学特性及体外三维软骨构建
目的 探讨滑液间充质干细胞(SF-MSCs)在无血清培养条件下的生物学特性,及其结合支架材料体外构建三维软骨的能力.方法 获取人的SF-MSCs,分别用有血清培养液和无血清培养液(MSCM-sf)体外培养,比较2种培养基培养的SF-MSCs增殖能力和细胞形态变化;取第3代MSCM-sf培养的SF-MSCs,检测细胞表面标志物的表达水平,并进行三向(成软骨、成骨、成脂)诱导分化实验以及结合聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架材料成软骨诱导实验.结果 MSCM-sf培养的SF-MSCs形态和增殖能力均优于有血清培养液培养细胞.第3代MSCM-sf培养的SF-MSCs表面阳性标志物CD73 (99.5％)、CD90(98.9％)和CD105 (96.5％)表达水平均大于95％,表面阴性标志物(CD34、HLA-DR和CD11b)总表达水平小于2％;三向诱导分化染色呈阳性;可与PGA/PLA复合物体外诱导成软骨.结论 SF-MSCs经MSCM-sf培养后能在维持细胞干性的前提下实现大量扩增,并可结合PGA/PLA生物支架体外构建三维软骨.
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原代卵巢上皮性癌干细胞样细胞的分离、培养及鉴定
目的 研究无血清培养基悬浮培养原代卵巢上皮件癌(卵巢痛)细胞,筛选并鉴定卵巢癌千细胞样细胞.方法 卵巢癌组织取自1例卵巢浆液性囊腺痛Ⅲ期、细胞分化2级的患者,分离的原代细胞培养于无血清培养液[添加表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)和胰岛素等细胞因子]得到球样细胞团细胞,并采用常规含血清的培养液进行培养得到贴壁细胞.应用定量PCR技术检测球样细胞团细胞表达干细胞标志基因的情况,应用四甲基偶氮唑蓝比色法、Hoechst 33342染色的流式细胞仪检测球样细胞团细胞的耐药性,并榆测球样细胞团细胞的裸鼠体内致瘤性.结果 在无血清添加细胞因子的培养条件下,原代卵巢癌细胞形成球样细胞团,这些细胞能够存活、增殖、具有自我更新的功能.球样细胞团细胞Nanog、Oct-4、Sox-2、nestin、CD_(133)、CD_(117)及ABCG2等干细胞标志基因的mRNA表达量为分化贴壁细胞的14～400倍.球样细胞团细胞还具有对顺铂和紫杉醇更强的耐药性,将顺铂与紫杉醇同时作用于贴壁细胞及球样细胞团细胞48及72 h后,球样细胞团细胞抑制率为31%、29%,显著低于分化细胞(抑制率为61%、73%),分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).球样细胞团细胞中Hoechst 33342染色阳性的细胞比例为21.83%,而贴壁细胞为83.04%,两者比较,差异有统计学意义(P<0.01).500个球样细胞闭细胞可在裸鼠体内成瘤,肿瘤组织的病理特征与原发肿瘤相似,且高表达上皮性肿瘤标志物CA_(125)和细胞角蛋白7.结论 采用无血清悬浮培养法从原代卵巢癌组织中获取的球样细胞团细胞,可能含有比例较高的具有增殖和分化能力的卵巢癌干细胞样细胞,并具有干细胞的功能.
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人卵巢癌细胞系A2780肿瘤干细胞分离培养与鉴定
目的:从人卵巢癌细胞系A2780中分离培养卵巢癌干细胞,并对其特性进行鉴定.方法:将A2780细胞消化,离心制成单细胞悬液,悬浮于含有生长因子的无血清培养基(SFM)中获得肿瘤细胞微球体,流式细胞仪检测细胞表面分子标志CD44和CD133的表达;Transwell小室侵袭实验检测肿瘤微球体的体外侵袭能力;CCK-8检测微球体细胞的增殖能力,比较两种细胞的倍增时间;将肿瘤微球体置于含有血清的培养基使其诱导分化,并观察其形态学变化.结果:A2780可在SFM中形成可悬浮生长、稳定传代的肿瘤细胞微球体.与贴壁的肿瘤细胞相比,微球体高表达干细胞标志CD44和CD133(P＜0.05),具有更强的体外侵袭力(t=9.354,P＜0.05)和增殖能力(t=13.682,P＜0.05),及更短的倍增时间(t=3.773,P＜0.05),在血清环境下可分化为普通的肿瘤细胞.结论:用含有生长因子的SFM悬浮卵巢癌细胞系A2780可获得卵巢癌肿瘤细胞微球体,此细胞球体中富集有肿瘤干细胞.
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大鼠星形胶质细胞无血清培养方法的研究
目的 探索应用无血清培养基进行大鼠星形胶质细胞原代培养及传代培养的方法.方法 取出生24 h内Wistar大鼠大脑皮质组织,机械吹打分散为单细胞后在无血清培养基中进行原代培养.细胞传代时分别使用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶或胰酶作为消化液,浓度为0.2 mg/ml或1 mg/ml的大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)终止消化作用,按照1∶2或1∶3的比例传代.显微镜下观察细胞生长状态,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)细胞免疫荧光染色方法鉴定细胞表型,MTF法检测传代细胞增殖情况.结果 细胞悬液静置15 min后更换新的无血清培养基培养,7d后显微镜下可见细胞生长良好,折光性强,胞体小而突起长;细胞免疫荧光染色鉴定显示＞95％的细胞为GFAP阳性细胞.与应用SBTI终止胰酶反应时未进行离心比较,低温、低速离心(4℃、3 000 ×g)3 min后,传代细胞可在无血清培养基中生长正常并增殖.MTT检测结果显示,EDTA-胰酶消化效果优于胰酶(A值分别为0.290±0.007、0.270±0.006,P＜0.010);使用浓度为0.2 mg/ml或1 mg/ml的SBTI终止消化(A值分别为0.290 ±0.013、0.290±0.017,P=0.820)及以1∶2或1∶3比例传代(A值分别为0.340±0.070、0.320 ±0.030,P =0.770),传代星形胶质细胞数量的差异均无统计学意义.结论 本研究建立无血清培养基进行大鼠星形胶质细胞原代及传代培养的方法,为避免血清干扰更好地开展体外星形胶质细胞功能的研究提供了新的细胞模型.
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人泪腺腺样囊性癌细胞系LACC中肿瘤干细胞的分离、培养和鉴定
目的 研究从人泪腺腺样囊性癌细胞系LACC中分离培养泪腺腺样囊性癌干细胞的方法,并对其特性进行鉴定.方法 实验研究.将LACC细胞消化、离心制成单细胞悬液,悬浮于无血清培养基(SFM)中获得肿瘤细胞微球体;应用有限稀释和单克隆形成实验确定该细胞系中肿瘤干细胞的比例;MTT法检测肿瘤微球体的增殖能力以及其耐药性;流式细胞仪检测细胞表面分子标志CD44+/CD24-在两种细胞中的表达情况;向SFM中滴加含有血清培养基诱导LACC肿瘤微球体分化,并观察其形态学变化.细胞增殖实验中两种细胞的吸光度(A)值和两种细胞的IC50比较采用t检验.结果 LACC细胞系中有(0.92±0.02)％的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活增殖形成自由漂浮的细胞球并可稳定传代;LACC肿瘤微球体和LACC贴壁细胞的IC50分别是22.53 mg/L,11.06mg/L(t =37.94,P ＜0.05),说明肿瘤微球体对顺铂具有更强的耐药性.流式细胞仪表面标志检测,LACC细胞CD44 +/CD24-比率为23.77％,而LACC肿瘤微球体CD44 +/CD24-比率为84.25％.在含血清环境下LACC肿瘤细胞微球体可贴壁分化为普通的腺样囊性癌细胞.结论 用含有生长因子的SFM悬浮人泪腺腺样囊性癌细胞系LACC可获得泪腺腺样囊性癌肿瘤细胞微球体,此肿瘤微球体中富集肿瘤干细胞,为人泪腺腺样囊性癌肿瘤干细胞的研究提供了一个理想的模型系统.
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无血清培养基在分离培养肿瘤干细胞研究中的应用
肿瘤干细胞的分离和鉴定是肿瘤干细胞研究的关键.目前已利用无血清悬浮培养法从视网膜母细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌等多种肿瘤中成功分离、富集出肿瘤干细胞,使这些肿瘤干细胞的生物学功能和特性逐渐被认识.本文从无血清培养基的构成及其在眼部和部分全身肿瘤干细胞的分离培养中的应用方面进行综述,以期为眼部肿瘤干细胞的进一步研究提供依据.
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两种培养条件对牙周膜干细胞生物学特性影响的对比研究
目的:对比无血清培养基和含血清培养基对原代培养、分离的人牙周膜干细胞(Human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)生物学特性的影响,为基于hPDLSCs的临床应用研究和药物试验奠定基础.方法:分别用含血清和无血清培养基培养分离hPDLSCs,倒置显微镜下观察细胞形态,CCK-8检测细胞增殖能力;流式细胞仪分析细胞表型;免疫荧光染色、real-time PCR检测PDLSCs成骨、成脂分化诱导后相关特异性蛋白及基因表达.结果:采用无血清与含血清培养条件原代培养分离的hPDLSCs形态相似;但无血清培养基组细胞增殖力更强;两种培养条件培养的hPDLSCs表型相似,均表达CD105、CD44、CD166、CD73和CD90,不表达CD45、CD3、CD14、CD38、HLA-DR、CD31和CD34;且阳性表达vimentin、α-SMA和N-cadherin,阴性表达CK18和E-cadherin.无血清培养条件培养的hPDLSCs具有成骨、成脂潜能,且诱导效能强于含血清培养者.结论:无血清培养基能够在体外培养扩增hPDLSCs,并维持其干细胞特性.采用无血清培养条件培养hPDLSCs可能更适合其在细胞治疗和实验研究中应用.
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脐血间充质干细胞无血清培养的实验研究
目的建立一种体外无血清培养扩增脐血间充质干细胞(MSC)的方法.方法从脐血中分离制备单个核细胞悬液,分别接种于有血清培养基及自制的无血清培养基中,比较两种培养条件下细胞生长情况,并进行瑞氏、过碘酸雪夫(PAS)、非特异性酯酶(NAE)和碱性磷酸酶(ALP)染色观察,流式细胞仪分析两种培养条件下MSC表面CD分子表达情况及细胞周期.结果有血清培养第3天出现较多贴壁细胞,8天有细胞丛生长,12～18天细胞融合成片,呈典型的成纤维细胞样外观.无血清培养第5天出现较多贴壁细胞,8天有细胞丛生长,14～20天细胞融合成片.单层融合的脐血MSC消化传代培养1周左右达融合,可继续传代扩增.终有血清培养获得(3.45士0.28)×108个细胞,无血清培养获得(2.97±0.26)×108个细胞,两者比较差异显著(P＜0.05).无血清与有血清培养21天,贴壁细胞PAS和ALP染色阳性,以成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞为主.流式细胞仪检测显示,两种培养条件下扩增后的脐血MSC均不表达CD34、CD13和CD45,而强表达CD166、CD29、CD105,较强表达CD54;无血清培养组G0/G1期细胞比例明显高于有血清培养组(P＜0.05).结论利用自行研制的无血清培养基添加一些辅助因子能较好地培养扩增间充质干细胞.
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人前列腺癌细胞株PC-3中类肿瘤干细胞的培养分离和初步鉴定
目的 从人前列腺癌细胞系PC-3中分离前列腺癌类干细胞并进行初步鉴定,为前列腺癌干细胞的进一步研究奠定基础.方法分别用含血清及无血清培养基培养前列腺癌PC-3细胞,流式细胞仪检测两种不同培养条件下前列腺癌类干细胞的比例,细胞免疫荧光鉴定前列腺癌类干细胞,MTT法测定并比较前列腺癌类干细胞与前列腺癌PC-3细胞的增殖能力及倍增时间,观察前列腺癌类干细胞诱导分化过程及其分化后细胞的双重免疫荧光表达.结果 少量PC-3细胞能在添加了人表皮生长因子(EGF)、人碱性成纤维生长因子(bFGF)和人白血病抑制因子(LIF)的无血清培养基中存活并形成悬浮细胞球团,无血清培养基中前列腺癌类干细胞比例(1.43%)显著高于含血清培养基(0.41%,P<0.05).前列腺癌类干细胞的增殖能力(培养7d的细胞数为9.6×10~5个)强于前列腺癌细胞(培养7d的细胞数为3×10~5个,P<0.000 5),倍增时间(21.90h)短于前列腺癌细胞(28.38h,P<0.000 5),免疫荧光显示前列腺癌类干细胞表达CD133;前列腺癌类干细胞球可在含血清培养基中贴壁分化,且双重荧光检测显示其同时低表达CD44和CD133.结论 体外培养的前列腺癌细胞系PC-3中含有少量能表达前列腺癌干细胞表面标志物的前列腺癌类干细胞,并可通过无血清培养基富集这类类肿瘤干细胞.
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有血清和无血清培养基联合法培养原代人牙龈上皮细胞
目的:探讨一种方便、快速、原代培养成功率高的人牙龈上皮细胞培养方法.方法:用含血清的DMEM培养基培养人牙龈组织上皮层7～10 d,然后换用无血清的EpiLife角化上皮细胞专用培养基加速已移出的上皮细胞分裂、增殖和游走.对培养出的上皮细胞进行组织学、形态学检测、单克隆角蛋白的鉴定和生长曲线测定.并比较联合培养方法和其他两种单独应用有血清DMEM培养基或无血清EpiLife培养基对上皮细胞生长的影响.结果:17～22 d内可获得供实验用上皮细胞,原代培养成功率为90.6%.倒置显微镜下见上皮细胞排列紧密,呈铺路石样生长.免疫组化染色角蛋白抗体阳性.同有血清培养基相比,无血清培养基能促进上皮细胞的迁移、游走,加速其分裂、增殖.结论:用有血清培养基和无血清培养基联合培养,可以方便、快速、成功地培养出人原代牙龈上皮细胞.
