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大鼠骨髓基质干细胞分化为胰岛样细胞
目的:探讨体外自体骨髓基质干细胞(MSC)定向诱导分化为胰岛样细胞的可能性,为进一步诱导分化胰岛细胞治疗糖尿病奠定实验和理论基础.方法:对Wistar大鼠骨髓基质干细胞(MSC)进行体外培养,通过不同的条件诱导MSC向胰岛样细胞分化:LN组,10 mmoL/L尼克酰胺+1 mmoL/L β-巯基乙醇的L-DMEM(含20 mL/L FBS)预先诱导24 h,10 mmoL/L尼克酰胺+1mmol/L β-巯基乙醇的无血清H-DMEM诱导10 h.HN组,含20 mmoL/L尼克酰胺的L-DMEM(20 mL/L FBS)预先诱导24 h,20 mmoL/L尼克酰胺的无血清H-DMEM诱导10 h.诱导细胞形态通过倒置显微镜观察,并通过免疫细胞化学检测分化细胞表达Insulin和Nestin.向3只Streptozotocin(STZ)诱导糖尿病大鼠皮下种植MSC分化胰岛细胞1×107,1 wk后观察大鼠血糖水平变化.结果:LN、HN组细胞均可见部分骨髓基质干细胞分化、增生,形成胰岛样细胞团,部分细胞向神经元样细胞分化,对照组细胞未见明显分化.免疫细胞化学显示Insulin在诱导细胞呈显著表达,Nestin在分化前细胞显著表达.皮下种植MSC分化胰岛细胞可有效降低STZ糖尿病大鼠的血糖水平.结论:体外诱导骨髓基质干细胞定向分化为胰岛样细胞存在可行性,本实验将可能为临床糖尿病干细胞治疗提供新的途径.
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HGF和FGF4体外诱导人骨髓CD45-CD117-细胞向肝细胞分化的研究
目的:探讨在HGF、FGF4诱导下人骨髓CD45-CD117-细胞能否向肝细胞分化,并探讨两种生长因子在诱导分化中可能的作用机制.方法:骨髓来自4名4-40岁健康志愿者的胸骨或髂骨.用两步磁式分离法分离出CD45-CD 117-细胞,分别用含有FGF4,HGF,HGF+FGF4或不加生长因子的DMEM培养基进行培养,相应地分为A,B,C,D四组.分别于新分离时和培养7 d,14 d,21 d,28 d时留细胞.备作免疫细胞化学检测AFP,CK18,白蛋白,PAS染色检测糖原等肝系细胞的特征型标志,RT-PCR检测C、D组细胞c-met(HGF受体)和FGFR2(FGF4R)mRNA表达情况.结果:A,B,C三组加生长因子诱导培养后的细胞均可检测到肝系细胞的标志,D组细胞不加生长因子培养后没有检测到肝系细胞的标志.c-met和FGFR2mRNA在新分离的和D组培养7 d,14 d时的细胞均有较弱的表达,而在C组细胞诱导培养7 d,14 d时表达升高.结论:HGF和FGF4可诱导人骨髓CD45-CD117-细胞向肝细胞样细胞分化.生长因子诱导分化的作用可能通过与其受体之间的正反馈调节.
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正常人结肠上皮细胞体外培养和鉴定
目的:探讨正常人肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)的分离、体外培养方法,为研究IEC以及与IEC相关疾病建立合适的细胞模型.方法:正常结肠黏膜取自外科手术的大肠恶性肿瘤患者距肿瘤10 cm的结肠组织,联合运用Ⅰ型胶原酶和嗜热菌蛋白酶消化分离IEC,接种于含多种促IEC生长的营养成分的DMEM培养液内,根据IEC和成纤维细胞贴壁时间的差异并运用胶原酶来纯化IEC,通过观察IEC生长状态、形态特征、超微结构及检测上皮细胞膜抗原对IEC进行鉴定.结果:联合运用Ⅰ型胶原酶和嗜热菌蛋白酶消化1 h可分离出健全绒毛隐窝单位,2 wk左右细胞可铺满整个玻片.免疫细胞化学检测该细胞为阳性细胞,纯度高.结论:联合运用Ⅰ型胶原酶和嗜热菌蛋白酶,可分离培养出高纯度未凋亡的ICE.
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抑癌基因p27Kip1及其Ser10突变体对HepG2细胞周期和增生的影响
目的:p27kip1氨基端第10号位置的丝氨酸(Ser10)磷酸化位点是该蛋白分子中重要的磷酸化位点,探讨人工诱变该位点丝氨酸为丙氨酸(S10A)后对肝癌细胞株HepG2细胞周期以及细胞增生的影响.同时比较野生型p27kip1和Ser10突变型p27kip1基因转染对肝癌细胞株HepG2细胞周期和增生的影响.方法:应用脂质体转染法将含人野生型和突变型p27kip1质粒DNA瞬时转染HepG2细胞,免疫细胞化学检测p27kip1蛋白的表达和细胞内分布,流式细胞计数仪分析细胞周期变化.结果:野生型和突变p27kip1蛋白转基因后HepG2细胞均可以G0期阻滞,且突变型的阻滞作用强于野生型(P＜0.05),细胞生长受到抑制.无血清培养96 h同步化于G0期,野生型和突变型p27kip1均分布于细胞核;而在20 mL/L血清继续培养8 h后野生型向细胞质转运而主要分布于细胞质,突变型仍然滞留于细胞核.结论:p27kip1的过度表达可明显抑制HepG2细胞的增生,p27kip1 Ser10酸化可能介导其细胞核外转运的重要分子机制.
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p16INK4a免疫细胞化学检测在筛查宫颈癌中的作用
目的 探讨p16INK4a免疫细胞化学检测在筛查宫颈癌及其癌前病变中的作用.方法 选择220例宫颈液基细胞学剩余标本,制作液基薄片进行p16INK4a免疫细胞化学检测,随访组织活检结果,并与高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)DNA检测结果进行对照.结果 p16INK4a在宫颈细胞学诊断的鳞状细胞癌(SCC)、鳞状上皮内高度病变(HSIL)、鳞状上皮内低度病变(LSIL)、非典型鳞状细胞-不除外上皮内高度病变(ASC-H)和非典型鳞状细胞-不能明确意义(ASC-US)病例的阳性表达率分别为100.0%(7/7)、92.2%(107/116)、24.3%(17/70)、100.0%(14/14)和36.4%(4/11).150例p16INK4a阳性者中,111例有组织活检诊断,其中宫颈上皮内瘤变(CIN)2级及以上病变者97例(87.4%);70例p16INK4a阴性者中,18例有组织活检诊断,无一例CIN2及以上病变.p16INK4a在CIN2及以上病变与在CIN1之间的阳性表达率差异有统计学意义(P＜0.01),而HR-HPV DNA的阳性率在两者之间差异无统计学意义.结论 p16INK4a在宫颈HSIL及以上病变中高表达,有利于高危病例的筛选.
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p16INK4A在宫颈非典型鳞状细胞中的诊断作用
目的 探讨p16INK4A免疫细胞化学检测在筛查宫颈非典型鳞状细胞(ASCUS)中的作用.方法 对148例宫颈细胞学检查结果为ASCUS的患者进行p16INK4A免疫细胞化学检测,随访组织活检结果,以病理学结果作为金标准.结果 148例ASCUS中,p16INK4A在经病理学确诊的慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和浸润癌的阳性表达率分别为0.9%、77.3%、91.7%、100%、100%.p16INK4A的表达在宫颈炎与CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ级之间,宫颈炎与宫颈鳞癌之间阳性率均有显著性差异(P＜0.05).结论 p16INK4A在宫颈CIN及以上病变中高表达,对ASCUS可有效地进行分流监测.
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膀胱癌特异性核基质蛋白-4在膀胱癌研究中的进展
膀胱癌是我国泌尿外科临床上常见的恶性肿瘤。根据肿瘤对膀胱壁的浸润深度，可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌。近70％的患者为非肌层浸润性肿瘤，膀胱癌整体5年生存率可达77％，仅5.5％的患者出现远处转移［1］。但由于膀胱癌具有较高的复发率，肿瘤恶性程度可伴随复发、逐渐进展等特点，使膀胱癌远期预后不佳［1］。低、中风险的膀胱癌患者在行经尿道膀胱肿瘤电切术后1年分别有20％、40％的复发率，高风险患者复发率可达90％［2］。膀胱癌的早期诊断和预后监测是治疗的核心。长期以来，膀胱镜活检一直作为早期诊断、术后随诊和预后监测的金标准。为了提高无创检测膀胱癌的水平，尿膀胱癌标志物的研究受到了很大的关注，美国食品药品管理局（FDA）已批准膀胱肿瘤相关抗原测定（BTAstat；BTAtrak）、核基质蛋白（NMP）22、纤维蛋白降解产物（FDP）、免疫细胞化学检测（Immuno-Cyt）和荧光原位杂交（FISH）用于膀胱癌的检测。多项研究显示 FISH 技术具有较高的敏感性和特异性［3-6］，目前已有多种商品化的 FISH 试剂盒用于临床。但对于有膀胱炎症、结石、放疗等病史者的尿液标本，反应性脱落细胞可能造成FISH 结果的特异性降低［7］。Hajdinjak［8］选用 FISH 技术检测尿液中脱落细胞染色体3、7、17和9p21的突变情况，Meta分析结果显示，FISH 诊断膀胱癌总体敏感度为72％，特异度为83％，ROC 曲线下面积为0.867。一项前瞻性研究结果显示，FISH 检测可用于非肌层浸润性膀胱癌的复发预测，其中9p21缺失可作为膀胱癌复发的独立预测因子，预测复发的敏感度为45.6％，特异度为85.3％［9］。然而，FISH 阳性的评判标准目前尚未统一，对检查员的技术要求高，检查耗时较长，且并非所有膀胱癌细胞的染色体都会呈现3、7、17或9p21的突变［10］。膀胱癌特异性核基质蛋白-4（bladder cancer specific nuclear matrix protein-4，BLCA-4）是一种无创性、高敏感度、高特异度的膀胱肿瘤检测指标，具有广阔的应用前景，现对其在膀胱癌研究中的进展作一总结。
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两种中药多糖诱导人内皮细胞表达造血生长因子的实验研究
血管内皮细胞(EC)是造血诱导微环境的重要组成成分.文献报道EC能分泌多种造血生长因子来调控造血.人参与当归是祖国传统医学的"补气"和"补血"要药,人参多糖(G PS)和当归多糖(APS)为其主要药物成分之一.近10年来我们课题组对APS以及G PS促进血细胞生成的调控机理进行了系统的研究,我们既往研究证明:APS对造血干/ 祖细胞增殖分化有显著刺激作用,GPS也可促进人粒单系造血祖细胞的增殖和分化,但其现代生物学机理尚不甚清楚.本研究采用造血生长因子生物活性检测与免疫细胞化学等技术 ,探讨APS和GPS诱导人内皮细胞表达GM-CSF、IL-3、IL-6与促进人造血祖细胞增殖分化的相互关系.材料与方法:(1)GPS:重庆中药研究所分离、提取、纯化,纯度＞90%;APS:兰州医学院血液病研究所惠赠,纯度＞85%.(2)人脐静脉内皮细胞株(Ecv304).(3)EC培养上清液的制备:分别制备对照组(不加任何刺激物,常规培养)、IL-1、GPS与APS体外诱导组(IL-1:100u/ml ,GPS:50μg/ml,APS:200μg/ml)的Ecv304细胞培养上清液 .(4)造血生长因子活性检测:以每种植5×104个骨髓有核细胞所生成的CFU-M ix、CFU-GM集落数评价各种Ecv304细胞培养上清液中造血生长因子的活性. (5)SP免疫细胞化学检测经IL-1、GPS和APS诱导和对照组Ecv304细胞的G M-CSF、IL-3、IL-6蛋白表达.实验结果表明:(1)经IL-1或GPS、A PS诱导制备的Ecv304细胞培养上清液能显著促进CFU-Mix、CFU-GM的增殖,其集落产率与对照组相比有显著的统计学意义(CFU-Mix:GPS组:52. 89±9.67,APS组:54.33±10.39,IL-1组:61.13±9.2 6,对照组:36.24±10.74;CFU-GM:GPS组:40.36±8.92 ,APS组:44.17±9.53,IL-1组:43.37±8.56,对照组:30 .78±11.45).(2)免疫细胞化学检测显示正常静止状态下EC胞浆内有棕黄色的 GM-CSF、IL-3、IL-6蛋白表达的阳性颗粒,但表达阳性率及强度均很低,经过IL-1或GPS、APS诱导后Ecv304细胞的GM-CSF、IL-3、IL- 6蛋白表达阳性细胞率和表达强度均明显提高.结果表明:经GPS、APS或IL-1诱导制备的内皮细胞培养上清液对CFU-GM和CFU-Mix的增殖分化有明显促进作用 ,提示其中造血生长因子(HGF)含量或活性有所增加.我们推测GPS和APS对内皮细胞表达HGF具有明显的刺激作用.现代研究认为:HGF与造血细胞膜上相应的HGF 受体结合,启动调控信号向核内转导,引起核内某些基因转录增强或其他基因转录抑制,终表现出蛋白合成改变,而导致细胞行为等变化.可见研究HGF的蛋白表达及调控能深入阐明造血调控的分子生物学机理.HGF生物学活性检测仅反映了内皮细胞条件培养液所含 HGF的生物学活性,HGF有其多效性和丰富性的特点,为进一步阐明GPS和APS能诱导和影响哪些HGF表达,本研究采用免疫细胞化学SP法对内皮细胞的GM-CSF、 IL-3和IL-6蛋白表达进行检测,结果表明:IL-1或GPS、APS诱导后内皮细胞的GM-CSF、IL-3和IL-6蛋白表达阳性率和强度积分值均显著高于对照组 ,这与生物学活性检测的结果相吻合.我们研究结果提示:GPS和APS调控造血的机理之一是上调造血微环境中的内皮细胞分泌造血调控因子来调节血细胞的生成.这或许是人参和当归"补气""补血"的现代生物学机理之一.
