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不同来源的人肠上皮细胞内毒素相关受体的表达
目的:研究人肠上皮细胞内毒素相关受体的表达规律,探讨其耐受内毒素的分子机制,为炎症性肠病(IBD)发病机制的阐明拓宽新的视野和思路.方法:用核糖核酸酶保护法(RPA)检测原代培养人正常肠上皮细胞(HNIEC)和人小肠上皮细胞株(HIC)内毒素相关受体CD14,Toll样受体4(TLR4)和MD-2 mRNA的表达;用免疫组化法检测人正常小肠黏膜上皮细胞和结肠黏膜上皮细胞CD14,TLR4和MD-2蛋白的表达.以表达TLR4,CD14和MD-2的人单核细胞系THP1细胞作为阳性对照.结果:HNIEC CD14、TLR4、MD-2mRNA均呈低表达,HIC CD14,TLR4,MD-2 mRNA均无表达.小肠黏膜上皮细胞和结肠黏膜上皮细胞3种内毒素受体CD14,TLR4,MD-2蛋白均无表达.结论:肠上皮细胞表面CD14、TLR4和MD-2呈低表达或不表达可能是其耐受内毒素作用的重要分子机制之一.
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正常人结肠上皮细胞体外培养和鉴定
目的:探讨正常人肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)的分离、体外培养方法,为研究IEC以及与IEC相关疾病建立合适的细胞模型.方法:正常结肠黏膜取自外科手术的大肠恶性肿瘤患者距肿瘤10 cm的结肠组织,联合运用Ⅰ型胶原酶和嗜热菌蛋白酶消化分离IEC,接种于含多种促IEC生长的营养成分的DMEM培养液内,根据IEC和成纤维细胞贴壁时间的差异并运用胶原酶来纯化IEC,通过观察IEC生长状态、形态特征、超微结构及检测上皮细胞膜抗原对IEC进行鉴定.结果:联合运用Ⅰ型胶原酶和嗜热菌蛋白酶消化1 h可分离出健全绒毛隐窝单位,2 wk左右细胞可铺满整个玻片.免疫细胞化学检测该细胞为阳性细胞,纯度高.结论:联合运用Ⅰ型胶原酶和嗜热菌蛋白酶,可分离培养出高纯度未凋亡的ICE.
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5株阪崎克罗诺杆菌体外侵染人肠上皮细胞能力分析
目的 分析5株阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii,C sakazakii)是否能够侵染人肠上皮细胞及其侵染能力.方法 将阪崎克罗诺杆菌与Caco-2细胞以100∶1的接种率接种后共培养4h,裂解细胞将进入细胞的菌落释放出来稀释涂布于LB琼脂平板,计数,计算侵染率.结果 从食源性疾病儿童病例中分离出的两种菌株C sakazakii13SJFB217、C sakazakii 14SJFB412对Caco-2细胞的侵染率分别达到0.0 219％和0.0 165％,从婴幼儿奶粉中分离的两株阪崎克罗诺杆菌C sakazakii 14SJ430、C sakazakii 14SJ431侵染率分别为0.0 071％和0.0 083％;来源于人的阪崎克罗诺菌株比来源于食品菌株对肠上皮细胞有更高的侵染能力.结论 石家庄市腹泻儿童粪便中分离到的2株阪崎克罗诺杆菌属于高侵染能力的菌株.
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重组幽门螺杆菌过氧化氢酶对SW480细胞应激反应的影响
近年来,氧活性物质(ROS)对肠屏障功能的影响日益受到重视,ROS的增加可损伤细胞成分,使肠上皮细胞的完整性破坏[1].过氧化氢酶(catalase,CAT)是众多氧活性物质清除剂的一种,它可将H2O2分解为H2O和O2,从而清除H2O2的细胞毒作用.我们在幽门螺杆菌(Hp)致病性研究中,克隆纯化了该菌的过氧化氢酶,意外地发现在我们的表达载体中该酶的活性远高于购自Sigma公司的纯化牛肝过氧化氢酶牛肝-CAT[2].SW480细胞为结肠癌细胞株,可以作为人肠上皮细胞用于实验研究.本文拟通过应用脂质过氧化物(LPS)刺激,观察重组Hp过氧化氢酶(Hp-CAT)和Sigma公司的纯化牛肝-CAT在应激情况下,对肠上皮SW480细胞的影响.
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肠致病性大肠杆菌毒力因子EspF对肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和白细胞介素-8的影响
目的 研究肠致病性大肠杆菌(EPEC)毒力因子EspF转染人肠上皮细胞(HIC)株时,血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-8水平的动态变化及与HIC凋亡的关系.方法 以Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测HIC的凋亡率,并用酶联免疫吸附测定法检测转染0,6、12、24、48 h细胞培养上清液中TNF-α、IL-6和IL-8浓度的变化.结果 EspF转染HIC后TNF-α、IL-6和IL-8活性均显著增加,HIC凋亡率在转染后逐渐增高,HIC凋亡率与TNF-α、IL-6和IL-8的水平呈正相关.结论 EspF可激活多种炎症介质和诱导HIC凋亡,EspF转染HIC后TNF-α、IL-6和IL-8水平的升高在EPEC致病过程中起重要作用.
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小鼠小肠RNA对人肠上皮细胞辐射损伤修复的研究
目的研究小鼠小肠RNA对受照人肠上皮细胞辐射损伤修复的作用.方法采用四唑盐(MTT)比色法和流式细胞仪分析细胞周期.结果照后4d,随着照射剂量的增加,人肠上皮细胞的存活率逐渐降低;照后给予小肠RNA组的LD50为14.2Gy,照射对照组的LD50为12.6Gy,DMF为1.13;照后24h,小肠RNA组的G2期细胞增多,而G1期细胞减少.结论小鼠小肠RNA可提高受照人肠上皮细胞存活率,其机理可能与调控细胞周期有关.
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双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素-2 mRNA的表达
目的检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞β-防御素-2(hBD-2)基因的激活作用及其活性组分.方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Nort hern杂交检测HT-29细胞hBD-2 mRNA的表达 ;采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞壁蛋白质成分. 结果 RT- PCR和Northern杂交分析显示,在正常培养条件下HT-29细胞无可见的hBD-2 mRNA表达信号 , 但在双歧杆菌菌体、细胞壁和胞壁蛋白刺激下均检测出显著的hBD-2 mRNA表达. 结论双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD-2 基因的表达,双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用的活性成分.
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番泻叶提取物对人肠上皮细胞生物学特性的影响
［兰梅，王新，吴汉平，樊代明. 世界化人消化杂志，2001；9(5):555-559］ 目的研究番泻叶提取对人肠上皮细胞生物学特性的影响. 方法应用MTT法观察番泻叶提取特对体外培养人肠上皮细胞生长的影响. 用流式细胞术观察番泻叶提取物(5 g*L-1)作6 wk后细胞增殖周期的变化，并用光镜和透射电镜观察长期番泻叶提取物作用下细胞形态学的变化. 细果大剂量番泻叶提取物(>25 g*L-1)可致体外培养的人肠上皮细胞全部死亡. 中等剂量(5 g*L-1)明显抑制细胞的生长(P<0.0001)，且呈剂量依赖关系，其IC50为7 g*L-1；小剂量(0.5 g*L-1)对细胞的生长无明显影响(P>0.05). 用番泻叶提取物(5 g*L-1)持续作用细胞6 wk后，可见其S期细胞数减少G2期细胞数增加，DI增高为1.11；光镜下见细胞贴壁差，生长缓慢，胞质中中毒颗粒增多；电镜下见细胞有明显空泡变性，凋亡细胞及凋亡小体多见，偶见病理性核分裂相. 结论番泻叶提取物对人肠上皮细胞生长的影响呈剂量依赖性，大剂量可致细胞生长延缓或死亡，小剂量无明显影响. 长期使用番泻叶提取物可使细胞增殖减慢，凋亡增加，异倍体DNA含量升高，促使细胞发生恶性转化.(何扬举)
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短链脂肪酸对内毒素/脂多糖引起的人肠上皮细胞屏障功能损害的作用及相关机制
目的 探讨短链脂肪酸(SCFA)对内毒素/脂多糖(LPS)引起的人肠上皮细胞屏障功能损害的作用及相关机制. 方法 建立人肠上皮细胞株Caco-2单层细胞培养模型.取细胞按随机数字表法分为对照组、LPS组及SCFA+LPS组.对照组细胞仅采用DMEM培养液常规培养,LPS组细胞在DMEM培养液中另加入终质量浓度为10μg/mL的LPS,SCFA+ LPS组细胞在DMEM培养液中另加入终质量浓度为10 μg/mL的LPS和SCFA(由0.5 mmol/L乙酸、0.01 mmol/L丙酸、0.01 mmol/L丁酸组成)的混合液培养.于培养0、1、2、6、12、24 h,取细胞采用电阻测定仪测定细胞的跨上皮电阻(TER),样本数为72.另取细胞同前分组及处理后,采用蛋白质印迹法于培养24 h后检测带状闭合蛋白1(ZO-1)、咬合蛋白及闭合蛋白1表达,样本数为6.另取细胞同前分组及处理后,采用免疫荧光法检测细胞形态及ZO-1的分布.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验及Bonferroni校正. 结果 (1)与对照组相比,LPS组细胞培养1～24 h的TER均明显降低(P＜0.01),SCFA+ LPS组细胞培养1～24 h的TER无明显变化(P＞0.05).SCFA+ LPS组细胞培养1～24 h的TER均较LPS组明显升高(P＜0.01).(2)与对照组的1.25 ±0.10、1.17 ±0.04、1.24 ±0.20相比,LPS组细胞培养24 h ZO-1、咬合蛋白及闭合蛋白1的表达量(0.74 ±0.23、0.76±0.11、0.77±0.11)均明显降低(P＜0.05),而SCFA+ LPS组细胞培养24 h ZO-1、咬合蛋白及闭合蛋白1的表达量(1.23±0.46、1.05 ±0.09、1.01 ±0.13)均与之相近(P＞0.05).与LPS组相比,SCFA+ LPS组细胞培养24 h的咬合蛋白和闭合蛋白1表达量均明显增加(P＜0.05),ZO-1表达量增加但差异无统计学意义(P＞0.05).(3)培养24 h对照组细胞排列紧密,近似鹅卵石样外观;ZO-1沿细胞膜呈连续、规则排列.LPS组细胞排列稀疏且形态改变;ZO-1沿细胞膜不规则排列,且偶有断裂和卷曲.SCFA+ LPS组细胞形态和ZO-1排列均较LPS组明显改善. 结论 SCFA可通过阻断LPS引起的TER下降、紧密连接蛋白表达下降和ZO-1分布异常,从而减轻LPS对人肠上皮细胞屏障的损害.
