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正常人结肠上皮细胞体外培养和鉴定
目的:探讨正常人肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)的分离、体外培养方法,为研究IEC以及与IEC相关疾病建立合适的细胞模型.方法:正常结肠黏膜取自外科手术的大肠恶性肿瘤患者距肿瘤10 cm的结肠组织,联合运用Ⅰ型胶原酶和嗜热菌蛋白酶消化分离IEC,接种于含多种促IEC生长的营养成分的DMEM培养液内,根据IEC和成纤维细胞贴壁时间的差异并运用胶原酶来纯化IEC,通过观察IEC生长状态、形态特征、超微结构及检测上皮细胞膜抗原对IEC进行鉴定.结果:联合运用Ⅰ型胶原酶和嗜热菌蛋白酶消化1 h可分离出健全绒毛隐窝单位,2 wk左右细胞可铺满整个玻片.免疫细胞化学检测该细胞为阳性细胞,纯度高.结论:联合运用Ⅰ型胶原酶和嗜热菌蛋白酶,可分离培养出高纯度未凋亡的ICE.
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发色底物法定量测定重组u-PA产品的总活性和单链比例
目的:建立一种发色底物酶水解方法定量分析重组尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)中的总活性及其单链酶原比例.方法:用嗜热菌蛋白酶激活u-PA转化成具有催化活性的双链尿激酶,再用尿激酶的发色底物S-2444测定u-PA的总活性.在非激活条件下,u-PA产品中的单链酶原不会催化水解S-2444底物,因而可以测定其单链酶原比例.结果:优化了嗜热菌蛋白酶激活u-PA的反应条件和尿激酶催化水解S-2444的反应条件.用这种方法测定了用CHO细胞表达的基因重组u-PA产品,单链比例大于98%,比活性约为11×104 U/mg.结论:用发色底物法测定重组人u-PA产品中的总活性和单链比例具有很好的重复性和准确性.
关键词： 尿激酶型纤溶酶原激活剂 活性 S-2444 尿激酶原 嗜热菌蛋白酶 -
尿激酶原糖基化对其表达稳定性的研究
目的:探讨尿激酶原糖基化对其表达稳定性的影响.方法:构建非糖基化尿激酶原,收取无血清培养上清为检测标本.用嗜热杆菌金属蛋白酶(thermolysin)激活尿激酶原.用抑肽酶(aprotinin)终止激活反应.生色底物S-2444用于显色反应.在405 nm波长处测定分光光度值(OD值)以确定双链成分的比例.在不用thermolysin激活的条件下,用公式计算单链尿激酶原比例.将重组尿激酶原和天然尿激酶原的培养上清置于4℃和37℃.每隔12 h测定总活性和单链成分比例.经过阳离子层析和凝胶层析纯化后,测定蛋白产品浓度、活性.SDS-PAGE电泳鉴定蛋白质分子质量和蛋白含量.结果:在37℃下天然尿激酶原(Asn302位带有糖基化侧链)的活性远高于重组尿激酶原(非糖基化).无论4℃或37℃,糖基化尿激酶原的单链比例均高于非糖基化尿激酶原.纯化后的天然尿激酶原蛋白产品浓度和活性均高于重组尿激酶原.SDS-PAGE提示天然尿激酶原浓度高于重组尿激酶原,分子质量低于重组尿激酶原.结论:较高的温度加速尿激酶原降解.Asn302位的糖基化位点有益于尿激酶原在培养上清中的稳定性.
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新生大鼠耳蜗基底膜上皮细胞层的分离酶消化与机械解剖可否使分离部分细胞失去活性
目的:探讨利用酶消化和机械解剖相结合方法分离新生大鼠耳蜗上皮细胞层的方法.方法:实验于2003-02/06在解放军总医院耳鼻咽喉科研究所进行.取新出生SD大鼠耳蜗基底膜后,将其放入含有嗜热菌蛋白酶的D-Hank溶液中,37℃孵箱孵育25 min进行酶消化,然后在高倍显微镜下应用自制的超细钨丝刀进行显微机械分离.对分离的耳蜗上皮细胞层进行半薄切片硼砂甲苯胺蓝染色与耳蜗冰冻切片苏木精-伊红染色进行形态对比.结果:①分离后的耳蜗基底膜上皮层在显微镜下呈透明的薄片样组织,其内的各种细胞形态保持完好.②硼砂甲苯胺蓝染色与苏木精-伊红染色进行形态比较发现,分离的耳蜗基底膜上皮层只含有基底膜上的上皮组织,包括耳蜗感觉上皮和非感觉上皮,即只有内毛细胞、外毛细胞、小上皮嵴、大上皮嵴和支持细胞,是纯净的上皮组织而没有任何的结缔组织.结论:利用37℃和25 min时间的酶消化法及机械解剖相结合的实验技术可以分离出纯粹的耳蜗上皮细胞层,为进一步纯化上皮内的各种细胞,进行各种基因转染试验以及耳蜗内的各种基础实验建立细胞模型并提供有效地实验手段.
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大鼠耳蜗大上皮嵴的分离和鉴定
目的:探讨利用酶消化和机械解剖相结合分离大鼠耳蜗大上皮嵴(GER)的方法.方法:取出生后0～3 d的SD大鼠耳蜗基底膜后,将其放入含有嗜热菌蛋白酶和少许DNA酶的D-Hank溶液中,37℃孵箱孵育25 min进行酶消化,然后在高倍显微镜下进行显微机械分离;对分离的GER细胞用免疫组织化学和RT-PCR扩增GER细胞特异性表达基因Hes1的方法进行鉴定,并进行GER的原代培养以验证其活性.结果:免疫组织化学染色表明分离的GER细胞是单一的上皮组织;对Hes1基因进行RT-PCR分析表明,分离的GER细胞表达该基因;分离的GER具有活性并可以进行原代培养.结论:利用酶消化和机械解剖相结合的方法可以分离出纯粹的有活性的GER,为进一步建立GER细胞系,进行各种基因转染试验以及耳蜗内的各种基础实验建立细胞模型提供有效的实验手段.
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应用嗜热菌蛋白酶快速分离活性纯椭圆囊感觉上皮细胞及其意义
目的 建立纯椭圆囊感觉上皮细胞(pure utricular sensory epithelial cell,PUSEC)的快速分离方法,为内耳细胞培养及毛细胞再生等机制研究提供大量的活性细胞.方法 通过对出生5天大鼠PUSEC的形态、生长特征的观察,采用透射电镜,紧密联接蛋白(ZO-1)、细胞角蛋白、波形蛋白免疫荧光细胞化学、RT-PCR检测毛细胞的特征性标志物Calretinin、Brn3.a mRNA的表达等方法鉴定PUSEC来源.结果 PUSEC呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态,细胞之间连接紧密,形成单层时呈"铺路石样"外观.可见由成百个PUSEC包绕液体而成的dome.PUSEC表达ZO-1和细胞角蛋白,不表达波形蛋白,表达毛细胞的特征性标志物Calretinin、Brn3.a的mRNA.结论 PUSEC来源于椭圆囊感觉上皮;纯椭圆囊感觉上皮细胞成功分离为内耳细胞培养及毛细胞再生机制的研究提供大量的活性细胞;成功分离的关键成份是嗜热菌蛋白酶.
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用嗜热菌蛋白酶进行人肠上皮细胞分离培养
目的探讨人肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IEC)的分离、培养及鉴定方法,为进一步研究IEC提供合适的细胞模型.方法取4～6个月合法引产胎儿小肠,用嗜热菌蛋白酶消化分离IEC,接种于含多种促IEC生长的营养成分的DMEM培养液内,根据IEC和成纤维细胞贴壁时间的差异来纯化IEC,通过观察IEC生长状态、形态特征、超微结构及检测上皮细胞膜抗原对IEC进行鉴定.结果嗜热菌蛋白酶消化2 h可分离出大量的健全绒毛隐窝单位,进一步培养获得的IEC,上皮细胞膜抗原均呈阳性.结论选用嗜热菌蛋白酶作为分离IEC的消化酶,可获得较纯的IEC,完全可供相关实验研究之用.
