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p27Kip1在不同时期大鼠耳蜗大上皮嵴的表达
目的观察p27Kip1在不同时期大鼠耳蜗的大上皮嵴中的表达情况,探讨p27Kip1在毛细胞分化和再生过程中的作用.方法对胚胎期12天、13天、14天、16天、18天、20天和出生后当天、2天、5天、7天、10天、14天等12个年龄段的大鼠耳蜗进行冰冻切片,然后以1:100抗p27Kip1小鼠单克隆抗体为一抗,1:200异硫氰酸荧光素标记山羊抗小鼠IgG为二抗,进行免疫荧光组织化学检查.结果①胚胎期14天时,p27Kip1开始在蜗管表达,其表达限于原始柯蒂氏器.原始柯蒂氏器中全部细胞均着色.②胚胎期20天左右时,p27Kip1开始在大上皮嵴细胞表达,而在毛细胞中停止表达,但在支持细胞中仍有表达.③出生后7天时,p27Kip1在大上皮嵴的表达达到强,之后其表达减弱,直至出生后2周时大上皮嵴结构消失.④p27Kip1在耳蜗发育成熟后仍在支持细胞中表达.结论p27Kip1可以作为听感觉上皮的一个标记物.p27Kip1在大上皮嵴细胞中表达,对正常数目毛细胞的产生和耳蜗嵌合体的形成有重要作用.p27Kip1在支持细胞中长期表达是哺乳类毛细胞不能再生的原因之一.
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大上皮嵴与哺乳类耳蜗毛细胞的分化和再生
位于感觉上皮外的大上皮嵴细胞经诱导能产生大量异位毛细胞,这是毛细胞再生的一条新的途径,将来也许有助于感音神经性聋的治疗.本文概述了大上皮嵴中异位毛细胞的产生及其分子水平机制,后介绍目前存在的问题及将来的发展趋势.
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转基因诱导新生大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞分化为毛细胞样细胞实验
目的 通过转染Hath1基因诱导大鼠耳蜗大上皮嵴细胞(greater epithelial ridge,GER)和小上皮嵴细胞(lesser epithelial ridge,LER)分化为毛细胞样细胞.方法 取出生后第1天的大鼠耳蜗,利用机械分离和酶消化相结合的方法分别分离出纯的GER和LER细胞,并转染Hath1基因,培养后做免疫组化染色观察.结果 GER和LER体外培养并转染Hath1基因后,免疫组化检测显示肌球蛋白(myosin Ⅶa)染色阳性,表达毛细胞的特异标记物.提示GER和LER已分化为毛细胞样细胞.结论 GER和LER细胞作为毛细胞前体细胞可以实现体外培养,转染Hath1后,可分化为毛细胞样细胞.
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大鼠耳蜗大上皮嵴及小上皮嵴细胞永生细胞系的建立
目的:建立大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生细胞系.方法:取P1大鼠耳蜗,分离出耳蜗上皮薄片组织,并与含SV40-LT抗原的逆转录病毒共培养,从而实现细胞的永生化.利用单克隆法纯化细胞系,并通过形态学、免疫组织化学等方法对细胞系进行鉴定.结果:大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生细胞系基本保持了细胞原代的表型特征:呈现上皮细胞样的多角形外观;不同世代的细胞均表达Islet1及SV40-LT抗原.该系目前已培养3个月,超过20代,传代时间为3～4 d,传代比例为1∶5.结论:本实验成功建立了大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞的永生细胞系,这为大、小上皮嵴细胞生物学特性及相关功能,特别是毛细胞再生及前体细胞移植治疗感音神经性聋方面的研究奠定了坚实的实验基础.
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大鼠耳蜗大上皮嵴的分离和鉴定
目的:探讨利用酶消化和机械解剖相结合分离大鼠耳蜗大上皮嵴(GER)的方法.方法:取出生后0～3 d的SD大鼠耳蜗基底膜后,将其放入含有嗜热菌蛋白酶和少许DNA酶的D-Hank溶液中,37℃孵箱孵育25 min进行酶消化,然后在高倍显微镜下进行显微机械分离;对分离的GER细胞用免疫组织化学和RT-PCR扩增GER细胞特异性表达基因Hes1的方法进行鉴定,并进行GER的原代培养以验证其活性.结果:免疫组织化学染色表明分离的GER细胞是单一的上皮组织;对Hes1基因进行RT-PCR分析表明,分离的GER细胞表达该基因;分离的GER具有活性并可以进行原代培养.结论:利用酶消化和机械解剖相结合的方法可以分离出纯粹的有活性的GER,为进一步建立GER细胞系,进行各种基因转染试验以及耳蜗内的各种基础实验建立细胞模型提供有效的实验手段.
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大鼠耳蜗毛细胞前体细胞与耳蜗间质细胞共培养的实验研究
目的 探讨耳蜗间质细胞对耳蜗毛细胞前体细胞--大上皮嵴(greater epithelial ridge,GER)细胞的诱导分化作用.方法 取出生后第1天大鼠20只,随机分为2组,每组各10只,利用酶消化和机械分离相结合的方法分别分离出纯耳蜗GER细胞和耳蜗间质细胞,并进行体外混合培养及形态学的观测,对共培养10天的标本行抗Calretinin(标记幼稚毛细胞)及抗p27抗体(标记支持细胞)的免疫细胞组织化学染色鉴定.结果 混合培养的耳蜗GER细胞和间质细胞易形成片状细胞岛,共培养10天后,有部分细胞表达Calretinin,亦有少数细胞表达p27,但无Calretinin及p27双标记者.结论 GER细胞与耳蜗间质细胞共培养,可以诱导GER细胞分化为毛细胞及支持细胞表型.
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大鼠耳蜗大上皮嵴的形态学演变
目的观察不同胚胎期的大鼠和新生大鼠耳蜗大上皮嵴形态上的变化.方法选取胚胎期14、16、18、20天和出生后当天、2、5、7、10、14天等10个时间段的大鼠耳蜗,分别进行冰冻切片和HE染色.结果毛细胞的分化成熟是从底回向顶回进行,顶回较底回有1～2天的延迟.大上皮嵴结构重排、细胞减少从腔侧开始,出生后2周左右当毛细胞分化成熟时消失.结论胚胎期14天前后是大上皮嵴形态演变的关键时期.大上皮嵴是耳蜗形态不成熟的标志之一.
