首页 > 文献资料
-
大鼠骨髓基质干细胞分化为胰岛样细胞
目的:探讨体外自体骨髓基质干细胞(MSC)定向诱导分化为胰岛样细胞的可能性,为进一步诱导分化胰岛细胞治疗糖尿病奠定实验和理论基础.方法:对Wistar大鼠骨髓基质干细胞(MSC)进行体外培养,通过不同的条件诱导MSC向胰岛样细胞分化:LN组,10 mmoL/L尼克酰胺+1 mmoL/L β-巯基乙醇的L-DMEM(含20 mL/L FBS)预先诱导24 h,10 mmoL/L尼克酰胺+1mmol/L β-巯基乙醇的无血清H-DMEM诱导10 h.HN组,含20 mmoL/L尼克酰胺的L-DMEM(20 mL/L FBS)预先诱导24 h,20 mmoL/L尼克酰胺的无血清H-DMEM诱导10 h.诱导细胞形态通过倒置显微镜观察,并通过免疫细胞化学检测分化细胞表达Insulin和Nestin.向3只Streptozotocin(STZ)诱导糖尿病大鼠皮下种植MSC分化胰岛细胞1×107,1 wk后观察大鼠血糖水平变化.结果:LN、HN组细胞均可见部分骨髓基质干细胞分化、增生,形成胰岛样细胞团,部分细胞向神经元样细胞分化,对照组细胞未见明显分化.免疫细胞化学显示Insulin在诱导细胞呈显著表达,Nestin在分化前细胞显著表达.皮下种植MSC分化胰岛细胞可有效降低STZ糖尿病大鼠的血糖水平.结论:体外诱导骨髓基质干细胞定向分化为胰岛样细胞存在可行性,本实验将可能为临床糖尿病干细胞治疗提供新的途径.
-
白藜芦醇对小鼠胰岛样细胞团的抗移植排斥作用及其IL-2、IL-1O表达的影响
目的 探讨白藜芦醇(Res)对小鼠胰岛样细胞团(ICCs)的抗移植排斥作用及相关细胞因子表达的影响.方法 采用BALB/c小鼠胚胎干细胞系B/c-ES在体外定向诱导形成ICCs,DIPA标记后移植至近交系昆明小鼠皮下.将小鼠随机分为环孢素A(CsA)组(阳性对照)、Res组、CsA+Res组和PBS组(阴性对照),每组6只,移植前3d开始给药(CsA及Res剂量均为50mg/kg),每天1次直至取材日.分别于ICCs移植后第5天和第10天取移植物常规病理切片,观察免疫排斥情况,部分切片行免疫组化染色,检测IL-2、IL-10表达情况.结果 移植后第5天各组均出现不同程度的移植排斥反应,除不用免疫抑制剂的PBS组外,其余各组均有移植细胞存活；Res组和CsA+Res组IL-2表达率分别为l7.5％及l4.5％,明显低于CsA组(59.5％,P＜0.05),而Res组与CsA+Res组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；Res组和CsA+Res组IL-10阳性表达率(分别为23％和48％)明显高于CsA- (12.5％,P＜0.05),且CsA+Res组明显高于Res组(P＜0.05).移植后第10天,仅CsA+Res组有少量移植细胞存活,其余各组未见移植细胞；Cs组IL-2和IL-10表达明显减弱,其余各组几乎不表达IL-2和IL-10.结论 Res可抑制小鼠ICCs移植后的急性排斥反应,其机制可能与下调IL-2表达及上调IL-10表达有关.
-
不同来源胰腺干细胞分化为胰岛样细胞团比较研究
目的 比较不同来源的胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞团的可行性及效率.方法 分别取孕16天胎鼠胰腺(A组,5只)、糖尿病大鼠胰腺(B组,5只)、正常大鼠胰腺(C组,5只)经体外分离纯化获得巢蛋白(nestin)阳性胰腺干细胞,免疫荧光组化法比较各组干细胞中PDX-1的表达情况;添加各种诱导分化因子,观察胰岛样细胞团出现的时间并行双硫腙染色鉴定.结果 各组均可分离纯化出Nestin阳性胰腺于细胞,免疫荧光组化显示A组PDX-1阳性的细胞数(50%)多于B组(45%)及C组(42%),经诱导分化各组胰腺干细胞均可分化成胰岛样细胞团,并经双硫腙染色鉴定证实为分化胰岛,但各组细胞团形成时间不同,以A组分化为胰岛样细胞团所需时间较短(10±3)天,而B组及C组所需时间较长,分别为15±2天及16±3天,各组分化时间存在统计学差异(P＜0.05).结论 不同来源的胰腺干细胞均可分化为胰岛样细胞团,以胎鼠胰腺干细胞定向分化为胰岛样细胞团的效率高.
-
雷公藤多糖诱导胰腺干细胞成胰岛样细胞团
背景:胰岛细胞来源不足说明胰岛细胞移植治疗糖尿病不能满足临床需要.因此,体外诱导胰腺干细胞分化为胰岛细胞成为研究的热点.目的:观察雷公藤多糖对小鼠胰岛来源的胰腺干细胞的诱导分化作用,从而探索中药诱导胰腺干细胞分化为胰岛β细胞的作用.方法:采用雷公藤多糖体外诱导经纯化的小鼠胰腺干细胞分化为胰岛细胞.胰岛样细胞团进行形态学观察,双硫腙染色和Western blot分析.结果与结论:①细胞形态学、细胞生长特性及免疫细胞化学染色显示,实验不仅得到了纯度高的小鼠胰腺干细胞,而且该细胞经雷公藤多糖诱导后能形成球形的胰岛样结构,有细长的蒂与培养瓶底部相连,双硫腙染色呈铁红色;②Western-blot检测显示,胰岛样细胞团中有β细胞素蛋白的表达;③结果表明,小鼠胰腺干细胞可以体外经雷公藤多糖诱导分化为含有β细胞的胰岛样细胞团.
-
胎鼠胰腺干细胞体内移植向胰岛样细胞团的分化
背景:由于干细胞的转分化受细胞外基质和基因程序的调控,因此在体外很难模拟体内干细胞巢的微环境而使干细胞定向分化,或许干细胞原位移植是可行方法之一.目的:探讨胎鼠胰腺干细胞在糖尿病鼠体内不同部位移植后分化为胰岛细胞团的可能性.设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2006-03/2007-04在深圳市人民医院中心实验室完成.材料:16 d龄SD胎鼠12只,10周龄200-250 g的SD雌鼠50只,均由广东省实验动物中心提供.方法:分离纯化胎鼠胰腺干细胞.经荧光原位杂交检测为雄性的第5代胎鼠胰腺干细胞用于体内移植.50只SD雌鼠取10只作为正常对照组,余40只通过腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,造模后分为4组:胰腺实质内移植组在胰腺实质内多点注射1×106个雄性胎鼠胰腺干细胞,肝内移植组行门静脉穿刺注射等量细胞悬液,肾包膜下移植组于左肾包膜下注射等量细胞悬液,模型对照组胰腺实质内多点注射相同体积的PBS液,10只,组,培养8周.主要观察指标:定期监测大鼠血糖及血浆胰岛素水平,观察胰腺、肝脏及肾脏组织病理学变化.结果:雄性胎鼠胰腺干细胞培养传3代后,巢蛋白阳性细胞率为74.1%.胰腺实质内移植组在移植后第3周血糖开始下降,血浆胰岛素水平逐渐升高;第5周血糖降至正常水平并维持,血浆胰岛素达到正常水平,病理学观察在胰腺内可见外源性胰岛样细胞团,胰岛素免疫组化染色呈阳性,巢蛋白免疫组化染色呈强阳性,荧光原位杂交检测Y染色体呈阳性.肝内移植组、肾包膜下移植组大鼠仍维持高血糖状态,相应组织内均未见外源性细胞团形成.结论:分离纯化的胎鼠胰腺干细胞存胰腺内原位移植后,于体内可转分化为胰岛样细胞团,并使血糖降至正常水平.
-
诱导型多能干细胞体外向胰岛素分泌细胞分化及对血糖的调控
背景：诱导小鼠多潜能性干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞能有效改善糖尿病小鼠血糖水平。目的：在体外将诱导型多能干细胞定向分化的胰岛样细胞团进行相关分子及蛋白水平检测，并观察其在体外和体内胰岛素分泌情况。方法：将体外培养的小鼠诱导型多能干细胞采用联合诱导剂分3个阶段对其进行诱导分化，并对每个诱导阶段形成的内胚层细胞、胰岛前体细胞和成熟胰岛细胞进行形态学观察和PCR检测相关基因的表达水平。对成熟的胰岛样细胞团进行双硫腙染色，ELISA检测体外释放胰岛素功能。将获得的胰岛素分泌细胞移植到糖尿病小鼠肾包膜下，观察其血糖水平变化。结果与结论：①体外成功获得的小鼠胰岛样细胞团，其结构呈球形，双硫腙染色呈铁红色，PCR检测到在mRNA水平上表达胰岛素基因；②ELISA检测到胰岛样细胞团在受到葡萄糖刺激时能够分泌胰岛素；③通过肾包膜方法将细胞团移植到1型糖尿病小鼠体内，对小鼠高血糖有明显的调控作用。
-
胰腺干细胞体外培养扩增的方法
背景:胰腺干细胞在体外培养时极易分化,很难获得足够数量的胰腺干细胞.目的:探讨一种简便易行的胰腺干细胞体外扩增培养方法.方法:分离新生昆明小鼠胰腺,原代培养三四天,成纤维细胞中出现呈集落生长的胰腺干细胞后,以0.02%EDTA消减成纤维细胞的数量,降低其比例后继续培养,待细胞铺满培养瓶底的80%时,重复三四次,逐渐提高胰腺干细胞的数量.检测胰腺干细胞特异性标志Nestin.尼克酰胺诱导胰腺干细胞分化;双硫腙染色对胰岛样细胞团进行检测.结果与结论:消减胰腺成纤维细胞的数量及比例后,胰腺干细胞可持续表现出活跃的分裂增殖能力,胰腺干细胞的数量显著增加;细胞保持球形、单个大核、细胞质折光性强、表达(Nestin).扩增的胰腺干细胞,以尼克酰胺诱导后分化为胰岛样细胞团,双硫腙染色阳性.提示,减少共培养中成纤维细胞的比例和数量,有利于胰腺干细胞的增殖,获得较多数量的胰腺干细胞.扩增后的胰腺干细胞仍保持未分化状态,在适当的体外诱导条件下能分化为胰岛样结构,具有一定的分化潜能.
-
胎儿胰岛中干细胞的分离与鉴定
目的:已证实胰腺来源的干细胞或祖细胞在体内外均能分化为胰岛素分泌细胞,但成人胰腺来源的干细胞增殖潜能较差.实验旨在分离并鉴定胎儿胰岛样细胞团中的干细胞,为糖尿病细胞移植治疗寻找可用的种子细胞.方法:实验于2006-10/2007-07在解放军军事医学科学院输血研究所干细胞与再生医学研究室完成.①对象:所用胰腺标本取自流产胎儿,胎龄14～20周,由解放军总医院妇产科提供,胎儿组织的使用得到孕妇本人的知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:无菌条件下取出胎儿胰腺,37 ℃下用0.5 g/L的V型胶原酶进行消化,分离得到胎儿胰岛样细胞团,悬浮培养,加入含体积分数为0.1胎牛血清、1 mmol/L丙酮酸钠、1 mmol/L谷氨酰胺、71.5 μmol/L β-巯基乙醇、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基,每日转皿除去贴壁细胞,72 h后挑选出悬浮生长的胰岛样细胞团予以贴壁培养,待长成上皮样单层细胞克隆时传代.③实验评估:将悬浮培养的胰岛样细胞团行双硫腙染色.另将少部分胰岛样细胞团及第4代细胞种植于24,96孔板中,采用免疫荧光染色检测细胞表面分子标志物增殖细胞核抗原、胰十二指肠同源盒基因1、Nestin、角蛋白19、波形蛋白、胰岛素、胰高血糖素、CD29的表达情况.MTT法分析第6代细胞的生长曲线.结果:①悬浮及贴壁培养的胰岛形态:刚分离出的胰岛呈簇状,边缘不规整,细胞排列较疏松.贴壁后胰岛样细胞团由簇状逐渐展开形成上皮样单层细胞克隆.传代后细胞形态发生改变,呈梭形或分支样,增殖较快.②悬浮培养的胰岛双硫腙染色检测:分离得到的胎儿胰岛样细胞团双硫腙染色呈阳性表达.③细胞表面标志免疫荧光染色检测:贴壁的第1代细胞大部分呈增殖细胞核抗原、胰十二指肠同源盒基因1、Nestin、波形蛋白阳性,极少数细胞呈胰岛素、胰高血糖素阳性,而角蛋白19为阴性.传代后仍呈增殖细胞核抗原、胰十二指肠同源盒基因1、Nestin、波形蛋白阳性,角蛋白19弱阳性,而胰岛素、胰高血糖素为阴性,所有细胞均不表达CD29.④细胞生长曲线:传代第3天细胞进入对数生长期,第6天进入平台期,细胞生长曲线呈"S"形.结论:由胎儿胰岛成功分离并培养出具有自我更新和良好增殖能力的干细胞,稳定表达多种胰腺干细胞特征性标志,而不表达胰岛细胞标志物,提示该细胞可作为候选的胰岛干细胞用于糖尿病细胞移植治疗.
-
人胎胰岛样细胞团体外增殖条件的研究
目的探讨人脐血清(UCS)、生长激素(GH)、烟酰胺(Nic)以及肝细胞生长因子(HGF)等多种因子对人胎胰岛样细胞团(ICCs)体外增殖的作用,为临床胰岛细胞移植提供数据.方法取8例水囊引产的胎儿胰腺, 胶原酶消化法制备胰岛样细胞团,分别加入UCS、GH、Nic、HGF及小牛血清等多因子组合培养,进行形态学观察,同时放射免疫法测定胰岛素分泌量.结果 8例胎儿胰腺组织体外培养均见到ICCs的生长和繁殖,培养6 d后,UCS+(GH+Nic+HGF)组ICCs获得量显著高于另外三个培养组.二硫腙染色示UCS+(GH+Nic+HGF)组ICCs均为B细胞,其纯度达80%～90%.结论 UCS、GH、Nic以及HGF共同作用于人胎胰岛细胞的体外培养时具有交互作用,能明显促进B细胞的增殖,显著提高胰岛样细胞团的获得率和胰岛素的分泌量.
-
新生大鼠胰腺来源干细胞的分离培养与鉴定
目的 从新生大鼠胰腺分离出一种胰腺干细胞,并对其进行初步鉴定.方法 采集大鼠胰腺,5.5 mg/mlⅣ型胶原酶消化,用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基培养,首次传代时利用差速贴壁分离上皮样细胞和成纤维样细胞.多次纯化上皮细胞,细胞密度为80％进行传代.对第4代的细胞进行免疫荧光染色,诱导向β胰岛细胞分化并利用高糖刺激胰岛素释放.结果 新生大鼠胰腺中的胰腺干细胞具有较强的增殖能力,可连续传代.第4代细胞经免疫荧光染色,显示胰十二指肠同源框因子l(PDX-1)、巢蛋白(Nestin)、神经元素3(NGN3)、波形蛋白(Vimentin)、胰岛素(Insulin)和C肽(C-peptide)阳性;经诱导分化后,经双硫腙(DTZ)染色为阳性,同时免疫组织化学显示PDX-1和C-peptide阳性;在糖刺激实验中,当无糖刺激时,细胞组胰岛素释放量为(5.3±1.5) pIU/ml,而诱导后的细胞组胰岛素释放量为(30.0±11.5) pIU/ml,两者比较差异有统计学意义(P =0.035).结论 分离的胰腺细胞是胰腺干细胞.
-
人胚胎胰腺源nestin阳性细胞的快速获取
目的建立一种胰腺nestin阳性细胞的快速培养方法.方法解剖分离12～24周龄胎儿胰腺,通过胶原酶Ⅴ消化获得胰岛样细胞团(ICCs);经原代培养及传代培养后获得nestin阳性细胞.结果免疫荧光法观察发现,传代培养4次后即可获得单纯的nestin阳性细胞.结论从胎儿胰腺中可快速获取单纯的nestin阳性细胞.
关键词： 胰腺 Nestin阳性细胞 胰岛样细胞团 胰腺干细胞 -
生长激素、肝细胞生长因子和烟酰胺对人胎胰岛细胞的增殖作用
目的研究生长激素(GH),肝细胞生长因子(HGF)和烟酰胺(NIC)对体外培养的人胎胰岛细胞的增殖作用及其交互作用.方法采用L8(27)正交设计法在体外培养的人胎胰岛细胞的各组中分别加入不同浓度及组合的GH,HGF和NIC,培养48 h后,收集各孔细胞,DTZ染色,计数.结果GH,HGF和NIC均起主要作用,HGF和NIC的交互作用不可忽视,佳的生长因子组合及适配浓度为GH(100ng/ml)HGF(25ng/ml)NIC(100mmol/L).结论GH,HGF和NIC均能促进体外培养的胰岛细胞的增殖,且组合GH(100ng/ml)HGF(25 ng/ml)NIC(100mmpol/L)的作用大.
-
体外诱导Balb/C小鼠ES细胞定向分化为胰岛样细胞团的形态观察
目的体外诱导Balb/C小鼠胚胎干细胞定向分化为胰岛样细胞团,观察细胞表面形态学的变化.方法选用Balb/C小鼠ES细胞,经过拟胚体(EB)发育分化4 d后开始定向诱导培养,不同时间段分别向细胞培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和尼克酰胺和N等细胞生长因子,使ES细胞定向分化为胰岛样细胞团.免疫细胞化学检测表达胰岛素和胰高血糖素的阳性细胞.原子力显微镜(AFM)原位扫描阳性细胞团.结果EB细胞生长为大小不一、境界清楚的细胞团,细胞团内细胞排列紧密.胰岛B细胞数量多,主要分布在细胞团的中央,边缘少,染色较淡.而表达胰高血糖素的A细胞主要分布在细胞团的边缘,数量相对较少.AFM扫描可见表达胰岛素的阳性细胞团,其表面有很多类似神经纤维束,接成网络状.在细胞质中,还有很多类圆形的颗粒物质,其大小几乎一致,粒径都处于0.5～1.0μm间.结论诱导分化得到的细胞团不仅有形态和功能上的成熟,而且还具备良好的组织结构,为细胞的移植疗法提供了可靠的凭据.
-
CD95L和TGF-β在与胰岛细胞共同培养的Sertoli细胞上表达
目的观察生物半透膜(BSM)包裹胰岛样细胞团(ICCs)与富含Sertoli细胞的睾丸样细胞团(SC)体外培养时,Sertoli细胞是否同时表达CD95L和TGF-β基因及体外抗免疫排斥作用的效果.方法 BSM包裹猪ICCs和SC,与人淋巴细胞进行培养.免疫组化染色观察CD95L、TGF-β的表达.通过测定胰岛素浓度和刺激释放实验,AO-PI荧光双染色和TUNEL染色,观察培养细胞的结构功能状况.结果 ICCs和SC共同培养时,许多Sertoli细胞表达CD95L和TGF-β蛋白.与淋巴细胞培养后,胰岛素分泌良好,刺激释放实验比值＞2.0,AO-PI荧光染色超过95%的细胞存活,TUNEL染色未发现凋亡细胞.结论 Sertoli细胞与胰岛细胞共同培养时可出现CD95L和TGF-β同时表达的微环境.
