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痰瘀同治方对心肌缺血再灌注损伤过程中自噬与凋亡相关基因调节作用研究
目的:观察痰瘀同治方对心肌缺血再灌注损伤(IR)不同阶段自噬与凋亡相关基因的调控作用.方法:将80只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、痰瘀同治方组(43 g·kg-1 ig)及3-MA干预组(13.5 mg·kg-1 iv).可逆性冠脉左前降支结扎缺血30 min,再灌注2h复制心肌缺血(MI)及IR模型,利用全自动生化仪检测血清肌酸激酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH)含量;采用RT-PCR法检测各组大鼠心肌自噬基因Beclin-1,心肌微管相关蛋白轻链3蛋白(LC3)及抗凋亡蛋白Bcl-2表达.结果:与假手术组比较,模型组大鼠在缺血及再灌注阶段血清CK,LDH含量及心肌Beclin-1,LC3 mRNA表达均显著增强,且Bcl-2 mRNA表达减弱(P＜0.01);与模型组比较,痰瘀同治组能降低缺血期血清CK及再灌注期CK,LDH含量(P＜0.05),抑制缺血期Beclin-1 mRNA及再灌注期Beclin-1,LC3 mRNA表达,上调缺血期及再灌注期Bcl-2 mRNA表达(P ＜0.05,P＜0.01);与假手术组,3-MA组比较,痰瘀同治组在缺血期可上调Beclin-1,LC3 mRNA表达(P＜0.01).经相关性检验,缺血期及再灌注期Beclin-1与Bcl-2均呈负相关表达(P＜0.01).结论:痰瘀同治方通过促进缺血期自噬发生及抑制再灌注期自噬过表达,同时促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达而发挥其对缺血再灌注损伤心肌的保护作用.
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甘草查尔酮A通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导肾癌细胞自噬的研究
研究甘草查尔酮A(licochalcone A,LCA)对肾癌细胞自噬的影响,并探讨其对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的调控作用.实验以肾癌细胞系786-O,769-P细胞为研究对象,采用MTT检测细胞增殖;Transwell法检测细胞迁移和侵袭;吖啶橙(acridine orange,AO)染色观察细胞自噬状态;Ad-GFP-LC3转染实验观察细胞中绿色点状聚集的自噬小体;Westem blot法检测自噬相关蛋白的表达,PI3 K/Akt/mTOR信号通路的变化,以及抑制该通路后检测诱导自噬的变化.结果表明,LCA抑制细胞增殖呈时间-浓度依赖性,同时剂量依赖性地抑制细胞迁移和侵袭;LCA能够诱导细胞内酸性自噬泡和自噬小体的增多;LCA可明显诱导LC3-Ⅱ,beclin 1,Atg5蛋白表达,降低p62蛋白表达,同时减少Akt,mTOR的磷酸化.使用PI3K/Akt抑制剂(LY294002)以及mTOR抑制剂(rapamycin,Rap)可促进LCA诱导自噬的发生.以上结果提示,LCA通过抑制PI3 K/Akt/mTOR信号通路进而抑制肾癌细胞增殖、迁移、侵袭,并诱导肾癌细胞发生自噬.
关键词： 甘草查尔酮A 肾癌 PI3K/Akt/mTOR 白噬 -
TLR7在结核分枝杆菌感染中的作用研究进展
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的威胁人类健康的全球致死性疾病之一.Toll样受体7(Toll like receptors 7,TLR7)是一种模式识别受体,主要识别单链RNA,参与胞内感染,同时也参与胞内病原体MTB所介导的免疫.以下就TLR7在MTB感染中介导的信号通路、作用机制及用于治疗的潜在价值作一综述.
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线粒体自噬在缺血再灌注损伤中的研究进展
缺血再灌注损伤是指缺血组织或器官再次获得血流灌注时对组织、器官造成的损伤作用.而缺血再灌注损伤时,线粒体即可产生的大量的活性氧且线粒体通透性发生改变从而诱发线粒体白噬.线粒体白噬功能的紊乱与机体多种疾病的发生有着密切的关系.本文旨在介绍近年来线粒体白噬的研究进展,重点阐述其在缺血再灌注损伤中的作用及机制.
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自噬对乙型肝炎病毒x蛋白诱导的人肝癌细胞的作用
目的 观察白噬对乙型肝炎病毒(HBV)x蛋白(HBx)诱导的人肝癌细胞(HepG-2)的作用.方法 运用HBx转染HepG-2细胞,采用免疫印迹技术检测自噬标记蛋白LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ,beclin1及溶酶体相关蛋白lamp2a的表达,透射电镜观察细胞超微结构变化,MDC染色白噬囊泡,观察HBx对细胞白噬水平的影响.结果 HBx转染可上调LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ(对照组灰度值0.520±0.086,转染组灰度值0.760±0.078,P＜0.05),beclin1(对照组灰度值0.220±0.087,转染组灰度值0.875±0.093,P＜0.05)及lamp2a(对照组灰度值0.120±0.064,转染组灰度值0.320±0.061,P＜0.05)的表达;电镜下可见Hep-G2细胞胞质中出现大量独立双层膜结构的自噬体,溶酶体深染及线粒体损伤.结论 HBx转染可上调Hep-G2细胞的自噬水平,提示在HBV感染所致的原发性肝癌的自噬中发挥了重要作用.
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自噬在熊果酸抑制人脐静脉内皮细胞增殖中的作用
目的 研究自噬在熊果酸( Ursolic acid,UA)抑制人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖中的作用,探讨UA抑制血管生长的机制.方法 体外培养HUVECs,分别采用不同浓度的UA和自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)+UA联合处理,采用MTT法检测UA对HUVECs增殖的抑制作用及其联合3-MA对HUVECs存活率的影响；透射电镜观察细胞的超微结构；微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1-LC3)免疫荧光和流式细胞术检测UA对HUVECs自噬表达水平的影响；RT-PCR检测自噬相关基因Beclin1和MAP1-LC3B转录水平的变化.结果 UA可抑制HUVECs增殖,且呈剂量依赖性；HUVECs经UA处理后,自噬泡数量明显增加:经UA处理后,可上调HUVECs中MAP1-LC3蛋白的表达水平,MAP1-LC3阳性细胞的荧光强度较对照组明显增强；UA处理HUVECs不同时间可上调MAP1-LC3B及Beclin1 mRNA的转录水平；而UA联合3-MA处理后,HUVECs的增殖抑制作片用明显增强.结论 UA抑制HUVECs增殖,并诱导其发生自噬,自噬在此过程中起保护性作用,抑制自噬可明显增强UA诱导的HU VECs死亡.
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自噬在大鼠坐骨神经横切后施万细胞去分化中的作用
目的 探讨坐骨神经横切后施万细胞去分化的机制. 方法 建立大鼠坐骨神经损伤模型.实验组隔天腹腔注射自噬抑制剂Ly294002,对照组注射Ly294002的溶剂,于横切后4、7、10 d取坐骨神经近侧端,用免疫组化方法检测施万细胞特异蛋白S100的表达,在电子显微镜下观察施万细胞的形态学变化. 结果 横切后4 d实验组S100的表达与对照组相比较有显著性差异;S100在幼稚的施万细胞表达很少,随着施万细胞的进一步成熟表达逐渐增多;电子显微镜下观察到施万细胞内有显著的自噬现象. 结论 自噬在施万细胞清除髓鞘碎片、受损的细胞器和胞质,从而使细胞在重返幼稚状态(去分化)中起重要作用.
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自噬在蛋白酶体抑制剂诱导的食管鳞癌细胞死亡中的作用
目的 观察自噬在蛋白酶体抑制剂MG132诱导的食管鳞癌细胞死亡中的作用.方法 用20 μmol/L MG132和(或)5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理人食管鳞癌EC9706细胞,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)双染色流式细胞术检测细胞凋亡率；吖啶橙(AO)染色荧光显微镜观察细胞酸性自噬泡的变化；Western blot法检测自噬相关蛋白Beclin-1及凋亡相关蛋白半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-9的表达.结果 流式细胞仪检测示MG132、3-MA及MG132+ 3-MA组细胞凋亡率为(57.37±0.81)％、(9.43±0.15)％、(79.40±0.92)％.MG132组经吖啶橙染色后,细胞内酸性自噬泡明显增加,呈明亮的红色荧光,而加入3-MA联合作用后,则上述现象被抑制.Western blot结果示对照组、MG132、3-MA及MG132+ 3-MA组Beclin-1和Caspase-9相对灰度值分别为0.57 ±0.01、0.90 ±0.03、0.49 ±0.14、0.65±0.01和0.61±0.05、0.88±0.02、0.70 ±0.01、0.98±0.02.结论 MG132可以诱导食管鳞癌细胞凋亡,并可激活其自噬；3-MA可能通过上调Caspase-9的表达增强MG132对食管癌细胞的杀伤作用.
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从AMPK介导的自噬研究淫羊藿总黄酮对自然衰老大鼠小肠屏障功能的调节作用
目的:从AMPK介导的自噬探讨淫羊藿总黄酮对自然衰老大鼠小肠屏障功能的调节作用.方法:SD大鼠按其不同发育阶段分为6月龄成年对照组,24月龄衰老组及淫羊藿总黄酮低、中、高剂量(10、20、60 mg/kg)组.用D-乳酸试剂盒检测各组血清D-乳酸含量;采用免疫组化检测各组小肠Claudin-1、Occludin、p-AMPK表达情况;Western blot检测小肠白噬相关蛋白Lc3Ⅱ、Beclin1表达情况.结果:与成年组比较,衰老组血清D-乳酸含量显著升高,小肠Claudin-1、Occludin、p-AMPK、Lc3Ⅱ、Beclin1表达显著降低(P＜0.01);与衰老组比较,淫羊藿总黄酮中、高剂量组血清D-乳酸水平显著降低,小肠紧密连接蛋白与自噬相关蛋白的表达显著升高(p＜0.01).结论:淫羊藿总黄酮可能通过上调AMPK介导的自噬,增加肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达,从而改善衰老大鼠肠道黏膜屏障功能障碍.
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烟酸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸对大鼠缺氧心肌细胞自噬流的影响及机制
目的 探讨炯酸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)对大鼠缺氧心肌细胞自噬流的影响及机制. 方法 取5只SD大鼠乳鼠,处死后取心脏,制备原代心肌细胞用于以下实验.(1)取原代心肌细胞,按随机数字表法分为常氧组、缺氧9h组、缺氧9 h+NAADP组,每组各5孔.常氧组细胞置于37℃恒温培养箱中常规培养9h;缺氧9h组和缺氧9 h+NAADP组细胞置于缺氧培养箱(含体积分数94％氮气、体积分数5％二氧化碳及体积分数1％氧气)培养9h,缺氧9 h+NAADP组细胞缺氧处理前加入终物质的量浓度10 μmol/L NAADP.细胞计数试剂盒8检测细胞活力.(2)取原代心肌细胞,按随机数字表法分为常氧组、缺氧9h组、缺氧9h+NAADP组、缺氧9 h+trans-Ned-19组及缺氧9 h+ trans-Ned-19+ NAADP组,每组各2孔.常氧组细胞置于37℃恒温培养箱叶常规培养9h;余4组细胞同实验(1)行缺氧处理.缺氧处理前,缺氧9h+NAADP组细胞加入终物质的量浓度10 μmol/L NAADP,缺氧9 h+trans-Ned-19组细胞加入终物质的量浓度1 μmol/L trans-Ned-19,缺氧9 h+ trans-Ned-19+ NAADP组细胞加入终物质的量浓度10 μmol/L NAADP和1μmol/L trans-Ned-19.蛋白质印迹法检测微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ型和P62的表达量.(3)取原代心肌细胞,同实验(1)进行分组及处理.免疫荧光法检测溶酶体的酸碱度.对数据行单因素方差分析和LSD检验. 结果 (1)常氧组细胞活力为1.114±0.024,明显高于缺氧9h组的0.685±0.079,P＜0.01.缺氧9h+NAADP组细胞活力为0.886 ±0.061,明显高于缺氧9h组(P＜0.05).(2)与常氧组比较,缺氧9h组细胞微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ型及P62表达量明显升高(P＜0.01).与缺氧9h组比较,缺氧9h+NAADP组细胞P62表达量明显下降(P＜0.01),微旨相关蛋白 1轻链3-Ⅱ型表达量无明显变化(P＞0.05);缺氧9 h+ trans-Ned-19组细胞微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ型及P62表达量均无明显变化(P＞0.05).与缺氧9h+NAADP组比较,缺氧9 h+trans-Ned-19+ NAADP组细胞微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ型表达量无明显变化(P＞0.05),P62表达量明显升高(P＜0.01).(3)常氧组细胞绿色荧光强度大,与红色荧光共染好,溶酶体内环境酸性较强.缺氧9h组细胞绿色荧光强度明显低于常氧组,溶酶体内环境酸性较常氧组减弱.缺氧9 h+NAADP组细胞绿色荧光强度较缺氧9h组明显增强,溶酶体内环境酸性较缺氧9 h组强,但仍低于常氧组. 结论 NAADP通过酸化缺氧后心肌细胞溶酶体内环境,促进自噬体降解,减少自噬溶酶体堆积,修复受损自噬流从而改善心肌细胞活力.
关键词： 缺氧 白噬 溶酶体 烟酸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
