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A20基因真核表达载体的构建及抑制内皮细胞组织因子(TF)表达的研究

朱楚洪;应大君;李黔宁;宋林;糜建红

摘要: 本研究旨在克降人A20基因与真核表达载体进行连接,并对其在内皮细胞的表达及功能进行研究.方法:将N-末端标记E-tag的人A20cDNA与穿梭质粒pCAGG S进行连接后得到重组表达质粒pCAGGSEhA20,将pCAGGSEhA20用脂质体包裹转染培养的人脐静脉内皮细胞,同时转染pCAGGS空载体进行对照;G418加压筛选重组细胞克隆.随机挑选pCAGGSEhA20转染的内皮细胞5株,调整为1000 0/ml,用鼠抗人E-tag抗体进行免疫荧光染色.转染pCAGGSEhA20阳性的内皮细胞及pCAGGS空载体转染对照细胞调整为10000/ml,每孔加200μ l,加LPS致终浓度为(100ng/ml),作用4小时后细胞固定,用anti-T F抗体进行免疫荧光染色及行TF原位杂交,图象分析相应的参数.结果:重组表达质粒p CAGGSEhA20酶切鉴定证实含有人A20cDNA,将pCAGGSEhA20和 pCAGGS转染的内皮细胞随机挑选G418抗性克隆数个,用抗E-tag抗体染色后 ,FACS检测其A20基因的表达情况,结果显示大多数克隆均有不同程度的表达,表达率为90%以上,选取高表达克隆扩增传代.LPS作用后表达A20基因的阳性细胞TF 仅有微弱表达或不表达,而对照细胞TF表达呈强阳性.结论:组织因子是炎症内皮细胞表达的细胞因子,在血栓形成中起重要作用.本实验表明A20基因能抑制LPS所致炎症内皮细胞表达TF,从而抑制血栓形成,在血栓预防和治疗中有重要作用.

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