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肺炎链球菌感受态缺陷影响细菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性
目的探讨肺炎链球菌在对抗β-内酰胺类抗生素时是否受感受态形成的影响.方法通过转化得到感受态缺陷菌株,采用半定量RT-PCR检测相关基因ciaH和cpoA在细菌感受态形成时的表达,用肉汤法检测各菌株的低抑菌浓度(MIC).结果细菌感受态时基因ciaH和cpoA的mRNA表达量增高(P＜0.05),野生菌感受态缺陷后的MIC值发生改变.结论肺炎链球菌的感受态形成可诱导ciaH和CpoA的表达增加,其感受态缺陷影响到其对β-内酰胺类抗生素的敏感性,但不同菌株的影响不同.
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肺炎链球菌感受态的形成影响毒力因子mRNA的表达
目的通过体外实验诱导的转化过程,探讨肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, S.pn)毒力因子的表达是否与环境诱导细菌感受态形成与转化有关. 方法采用插入失活的方式断裂S.pn感受态形成的关键基因comE,获得感受态缺陷菌株.以实时定量RT-PCR测定毒力因子在感受态缺陷菌与野生菌的表达是否存在差异.所测毒力因子有自溶酶、溶血素、胆碱结合蛋白、S-IgA、神经氨酸酶、透明质酸酶. 结果 S.pn在540nm处吸光度(A)值=0.044～0.127之间产生感受态.自溶酶、神经氨酸酶、透明质酸酶3种毒力因子的表达,野生菌组表达高于缺陷菌组,两均数间比较的t值分别为2.96(P＜0.05)、2.8(P＜0.05)、4.56(P＜0.05). 结论细菌感受态能启动自溶酶、神经氨酸酶、透明质酸酶3种毒力因子的表达,提示S.pn的感受态能影响其毒力因子的表达.
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人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建
目的 克隆人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因编码区cDNA序列,构建并鉴定TGF-β1真核表达载体.方法 设计含有EcoRⅠ和XholⅠ酶切位点的TGF-β1cDNA引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,以人白细胞mRNA为模版,扩增TGF-猹1基因,纯化PCR产物,TA克隆,双酶切与pcDNA3质粒表达载体连接,转化感受态大肠杆菌JM109,酶切鉴定阳性重组子,并进行序列测定.结果 琼脂糖凝胶电泳显示,用双酶切后形成分子量1.2kb的条带,符合物理图谱,表明表达载体构建成功,序列测定结果与预测结果完全一致.结论 成功克隆了TGF-猹1基因,并成功地构建了真核表达载体pcDNA3-TGF-β1.
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肺炎链球菌实验室转化模型的方法学研究
目的建立肺炎链球菌的实验室转化模型,以便于对该菌的各种目的基因进行重组改造.方法通过检测细菌的吸光度值,在特定的菌密度时利用感受态刺激因子(CSP)诱导,采用血平板培养筛选的方法,获取发生转化了的菌株.通过抗生素培养基培养和PCR鉴定是否发生转化.结果发现不同肺炎链球菌株的转化适菌密度不同,构建了肺炎链球菌感受态缺陷菌株,建立了肺炎链球菌在实验室的转化模型.结论实验室条件下,在不同菌密度时可利用CSP诱导肺炎链球菌成为感受态而发生转化.
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pUC19-pbp2b重组质粒转化对肺炎链球菌感受态菌株耐药性的影响
目的 探讨pUC19-pbp2b重组质粒转化对肺炎链球菌(SP)感受态菌株耐药性的影响.方法 收集13株对青霉素不敏感的SP菌株,其中8株青霉素结合蛋白(PBPs)编码基因pbp2b未突变,5株pbp2b基因突变,制备SP感受态.化学合成含SSN保守区的pbp2b基因片段,构建pUC19-pbp2b重组质粒,将重组质粒转化感受态菌株.测定青霉素、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松和头孢吡肟5种β-内酰胺酶类抗生素(BLA)对转化前后SP感受态菌株的小抑菌浓度(MIC).结果 pbp2b基因扩增产物可见约300 bp的特异条带,13株SP菌株均能形成感受态.与转化前菌株比较,5种抗生素对转化后菌株的MIC均降低(P＜0.05).5种抗生素对5株转化后的pbp2b基因突变菌株的MIC均降低(P＜0.05).结论 外源重组质粒转化SP感受态可以协助减缓SP耐药性的进展.
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肺炎链球菌自然转化机制的研究进展
肺炎链球菌的自然转化与其自身的染色体基因突变有着密切联系.研究发现,调控肺炎链球菌发生转化的关键基因是操纵子comCDE,它调控肺炎链球菌产生感受态,从而能获取外源基因.comC的产物CSP可诱导基因comDE的表达,而comE可反过来诱导comC的表达.comAB有修饰和运输comC的转录及翻译产物的作用.ciaRH则有抑制comC表达的作用.comE可通过诱导comX表达,从而诱导一系列的基因表达使细菌发生转化.一些环境因素可影响肺炎链球菌自然转化的发生.氧气可通过基因nox调节肺炎链球菌的转化发生,其中可能有基因ciaRH和MicAB的参与.Ca2+对其转化的影响可能是通过调节基因ciaRH而实现的.而pH值则可能是通过改变CSP的活性对转化进行调节.
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变形链球菌信号传导系统研究进展
变形链球菌通过信号传导系统来感应外界环境信号,改变相关基因的表达以适应环境因素的变化.本文介绍了信号传导系统的基本结构和作用机制,以及信号传导系统对变链菌生物学活性的调控作用,如介导感受态的产生、调控生物膜的形成等.探明信号传导系统在变链菌致病过程中的作用机制,可为控制变链菌感染提供另一种思路.
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抗生素诱导的细胞感受态与肺炎链球菌的耐药性
针对环境中的压力,细菌会采取不同的响应以维持自身的稳定.某些抗生素能够诱导肺炎链球菌转变为感受态细胞,提高细胞转化率,从而产生更适宜生存的耐药突变株.本文根据近年来有关感受态的研究,重点阐述肺炎链球菌中抗生素诱导的感受态与耐药性之间的关系.
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Quicktrans转化试剂盒的应用
目的:明确快速转化法的转化效率及影响因素.方法:采用Quicktrans 快速转化试剂盒制备感受态细胞,对不同类型的质粒进行转化.同时分析菌种、冻存时间对转化的影响,并与常规氯化钙法进行转化效率的比较.结果:快速转化法可有效转化不同类型的质粒,对于同一种质粒,不同菌种和冻存时间对转化效果无影响.快速转化法转化效率高于常规氯化钙法.结论:快速转化法是一种快速、有效的转化方法.
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肺炎链球菌转化模型的建立
目的:建立一种更加稳定、高效的肺炎链球菌实验室转化模型,以便于对该菌的各种目的基因进行重组改造.方法:分别用改进方法和既往方法制备肺炎链球菌感受态细胞,转化外源DNA,获取发生了转化的菌株,通过抗生素培养基培养和PCR鉴定是否发生转化;并计数抗生素筛选平板上的转化菌落.比较两者的转化率,以确定更佳的转化模型.结果:肺炎链球菌334菌株、31203菌株用改进方法的转化率分别为(0.89±0.20)%,(0.71±0.10)%,高于既往方法的转化率[分别为(6.2±1.4)×10<'-3>%,(5.7±1.1)×10<'-3>%],构建了肺炎链球菌感受态缺陷菌株,建立了改进的肺炎链球菌实验室转化模型.结论:改进的转化模型实现了稳定的肺炎链球菌实验室转化,能方便研究者对该菌进行各种遗传操作,为深入研究其致病的分子机制提供了一个技术平台.
