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pcDNA3.1(+)GDNF真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达
目的构建pcDNA3.1(+)胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达.方法将GDNF逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)产物克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以Fu Gene 6介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性.结果 RT-PCR产物为640bp特异片段,pcDNA3.1(+)GDNF重组体经酶切后分别出现640bp和300bp片段,测序分析与文献报道结果完全一致,表明重组pcDNA3.1(+)GDNF表达质粒克隆成功.可见pcDNA3.1(+)GDNF质粒在真核动物细胞中得到表达,GDNF蛋白能够刺激含多巴胺的细胞生长,表明重组质粒能在真核细胞中表达出具有活性的GDNF蛋白.结论以Fu Gene 6介导pcDNA3.1(+)GDNF质粒转染真核细胞为基因治疗帕金森病奠定了一定基础.
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一种简便有效的枯草杆菌质粒克隆方法
目的在用枯草杆菌质粒克隆并表达白喉毒素突变型DT-del148时,出现A700T突变,导致Ile209Leu氨基酸取代,为纠正这一突变,设计一种简便有效的枯草杆菌质粒克隆方法.方法首先对含I209L突变的载体PSM604-DT-del148-I209L DNA进行计算机限制内切酶谱分析,以位于PflMⅠ及HindⅢ间的唯一切点的限制内切酶KpnⅠ消化,然后去磷酸化,热灭活相应酶,加入不含I209L突变的大肠杆菌质粒PET15b-DT-del148,再以PflMI、HindⅢ消化,浓缩后进行连接、转化、筛选克隆,后DNA序列分析.结果经限制内切酶消化及序列分析,所有转化子均含目的基因片段.载体DNA仅需300 ng,转化效率达4.5×102转化子/μg;结论方法简便、有效、快捷,成本低、成功率高,值得推广和借鉴.