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弯曲菌耐药机制研究进展
弯曲菌是全球范围内引发人类急性胃肠炎的主要食源性致病菌之一.虽然人类感染弯曲菌后死亡率较低,但可能导致严重的并发症如格林-巴利综合征、肠易激综合征等.氟喹诺酮类、大环内酯类等抗生素是临床治疗感染性胃肠炎的经验用药,但弯曲菌多重耐药性的出现和耐药程度的加剧给临床用药带来了严峻的挑战.本文结合国内外新的耐药文献,选择临床治疗弯曲菌感染常用的五类抗生素,综述了弯曲菌对其产生的耐药作用机制和传播规律,以期为临床医疗和畜牧养殖业提供合理的用药方案,并为新型抗生素的药物研发提供理论依据.
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问号钩端螺旋体血清群LipL32基因型分析及其重组蛋白的免疫学鉴定
目的探讨15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)中国参考标准株及2群2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在主要外膜蛋白(MOMP)基因(LipL32),克隆并构建该基因的原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性. 方法常规酚-氯仿法提取上述钩体株基因组DNA,高保真PCR扩增全长LipL32基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列并构建表达系统,不同浓度IPTG诱导后用SDS-PAGE检测rMOMP表达情况.分别用兔抗TR/patocⅠ钩体全菌抗血清、rMOMPs免疫兔血清的Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性,显微镜凝集试验(MAT)检测rMOMPs免疫兔血清的交叉凝集效价,钩体细胞黏附模型检测抗体阻断效果. 结果上述17株钩体均有LipL32基因,但可分LipL32/1和LipL32/2两种基因型.13个LipL32/1和4个LipL32/2基因型之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.12%～96.60%和97.79%～98.16%.IPTG诱导后rMOMP1和rMOMP2表达量分别占细菌总蛋白的40%和10%.rMOMP1和rMOMP2均能与兔抗钩体TR/patocⅠ血清发生结合反应,免疫家兔可对上述17株钩体产生1∶2～1∶64 MAT效价的凝集抗体.1∶2～1∶16稀释的兔抗rMOMP1和rMOMP2血清均能有效地阻断钩体的黏附. 结论所有检测的钩体具有LipL32/1或LipL32/2基因.所构建原核表达系统能表达rMOMP1和rMOMP2.rMOMP1和rMOMP2有良好的免疫原性和免疫反应性.rMOMP1和rMOMP2是具有属特异性的钩体表面外膜蛋白抗原,能诱生交叉凝集、阻断黏附的抗体.
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沙眼衣原体主要外膜蛋白T、B细胞多表位基因的表达及其鉴定
目的 对沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位进行预测和选择,并进行Ct MOMP多表位基因克隆和多表位蛋白的原核表达及其抗原性分析,为研制多表位Ct疫苗提供基础资料.方法 利用SYFPEITHI法和多项式方案结合预测HLA-A2限制性的CtMOMP的CTL表位,选取含多个CTL表位的基因片段作为目的基因,兼顾目的基因上下游存在的TH和B细胞表位的基因,共同组成含CTL、TH和B细胞表位的多表位基因.多表位基因经密码子优化后进行全序列合成,克隆入原核表达载体pET-32a(+),经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)表达并纯化,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物.结果 经预测筛选得到了多个MOMP HLA-A2限制性的CTL表位,成功克隆了含CTL、TH、B表位的MOMP多表位基因,并在大肠杆菌中获得了高效表达.表达产物的相对分子质量(Mr)约24×103,与预期Mr相符,并用Western blot方法初步证实多表位蛋白有抗原特异性.结论 成功设计了Ct MOMP的T、B细胞多表位基因,并证实在原核表达系统中获得正确表达的多表位蛋白具有良好的抗原性.
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沙眼衣原体主要外膜蛋白亚单位疫苗的研究进展
沙眼衣原体主要外膜蛋白的亚单位疫苗成分无毒力,能诱导中和抗体和特异性细胞免疫反应产生,对机体起到预防和一定的特异性治疗作用,是有前途的新型疫苗之一.目前,研究的重点集中于主要外膜蛋白功能构象、有效T-B表位筛选及选择合适的载体佐剂增强免疫原性,并探讨恰当的接种途径,诱导高效的抗体和细胞免疫,同时加强黏膜防御.
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LTB-MOMP融合基因表达载体的构建及其在原核细胞中的表达
目的 构建含大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LTB)和鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)融合基因(LTB-MOMP)的表达载体,并在原核细胞中表达融合蛋白.方法 应用PCR从质粒EWD299和鹦鹉热衣原体中扩增LTB和MOMP基因,经与柔性肽连接后,插入pET-28a载体中,酶切鉴定正确后,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达,并纯化目的 蛋白.SDS-PAGE和Western blot分析外源蛋白的表达及表达产物的抗原特异性.结果 重组工程菌可以表达相对分子质量约为54 000的LTB-MOMP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的42%,LTB-MOMP融合蛋白具有良好的抗原特异性.结论 已成功构建了LTB-MOMP融合基因表达载体,并在原核细胞中获得表达.
关键词： 鹦鹉热衣原体 大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位 主要外膜蛋白 原核表达 -
沙眼衣原体主要外膜蛋白抗原表位的研究进展
沙眼衣原体是人类生殖道感染的常见病原菌,其主要外膜蛋白具有较强的抗原性,是目前沙眼衣原体疫苗靶抗原的佳选择.本文就沙眼衣原体主要外膜蛋白的CTL表位、Th细胞表位和B细胞表位的研究进展作一简要综述.
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沙眼衣原体感染免疫和DNA疫苗的免疫效应
沙眼衣原体是沙眼和性传播疾病的主要病原体之一,沙眼衣原体感染还使HIV-1更易传播.沙眼衣原体感染宿主能诱发机体保护性的体液免疫和细胞免疫,在初次感染,是细胞免疫而不是抗体起主要保护作用;对于继发感染,保护性免疫高度依赖Th1型CD4+T细胞,并且诱导迟发型超敏反应.发展疫苗是预防沙眼衣原体感染的有效途径.
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性病门诊男性尿道炎患者沙眼衣原体基因分型
目的 了解性病门诊就诊的尿道炎男性患者中,沙眼衣原体血清型分布情况.方法 采集2013年1-12月中国医学科学院皮肤病医院性病门诊有尿道炎症状的男性患者的尿液,荧光定量PCR检测沙眼衣原体,对沙眼衣原体阳性患者的尿液提取DNA,用巢式PCR法扩增沙眼衣原体主要外膜蛋白基因ompA的VS1-VS2片段,然后对此片段测序,测序结果用DNAStar5.0软件与每种血清型的参考菌株做比对,分析其血清型.结果 对2013年432例男性尿道炎患者进行了沙眼衣原体筛查,阳性标本143例,阳性率33.1％.143例沙眼衣原体阳性标本,127例扩增出ompA的VS1-VS2片段,16例未扩增出.127例阳性标本经测序分析获得9种血清型.血清型分布情况如下:E型29(22.83％)、F型28株(22.05％)、D型19 (14.96％)、G型16株(12.60％)、J型16株(12.60％)、K型8株(6.30％)、H株5株(3.94％)、I型3株(2.36％)、B型3株(2.36％),E、F、D、J、G型占85.02％.与标准菌种比对,发现127例菌株中有14株存在碱基突变,为同义突变.结论 性病门诊男性尿道炎沙眼衣原体血清型主要是E型、F型、D型和G型,与20年前相比,E型菌株比例有所下降,J型菌株比例增高.
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沙眼衣原体E型MOMP基因原核表达载体的构建和纯化
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)共有19个血清型,其中D～K血清型则可通过性传播,引起人类泌尿生殖道感染,并可引起并发症.沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)携带Ct亚型等多种抗原决定簇,是诊断试剂和疫苗开发的基础.本研究选择MOMP基因作为研究对象,用PCR技术扩增E型沙眼衣原体MOMP基因片段,再将其定位插入到原核表达载体pGEX中,构建重组表达质粒.然后将重组表达质粒转化人大肠杆菌(BL-21)中,并用酶切分析、PCR扩增及部分序列测定等方法对重组质粒进行鉴定.诱导表达,用SDS-PAGE及蛋白印迹进行鉴定,并以亲和层析柱纯化表达产物,为进一步研究该蛋白的生物学特性,了解衣原体的致病机制奠定基础.
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沙眼衣原体主要外膜蛋白21-387的原核表达及其免疫原性
目的：探讨沙眼衣原体（Ct）E血清型主要外膜蛋白（MOMP21-387）的原核表达及其免疫原性。方法：利用PCR方法扩增Ct E血清型MOMP第21至第387氨基酸的基因序列，克隆至pET21a（+）原核表达载体构建重组质粒pET21a（+）/MOMP21-387，并进行原核表达和纯化，经SDS-PAGE和Western blot法分析鉴定后，通过BALB/c小鼠免疫检测MOMP21-387蛋白的免疫原性，即通过ELISA法检测小鼠血清IgG和生殖道分泌物IgA抗体反应，乳酸脱氢酶（LDH）法检测其脾细胞的特异性杀伤作用。结果：在原核表达系统成功表达了MOMP21-387融合蛋白，经SDS-PAGE及Western blot法鉴定在相对分子质量（Mr）约44000处出现特异性条带；并经Ni-NTA亲和层析的方法获得了纯化的MOMP21-387融合蛋白，免疫BALB/c小鼠可诱导产生特异性血清IgG抗体和生殖道分泌物IgA抗体，至第6周达到高峰，MOMP21-387组的IgG和IgA抗体较PBS组差异均有统计学意义（P＜0.05）；LDH检测结果显示，MOMP21-387组小鼠脾细胞对靶细胞的杀伤率，在10：1、20：1和40：1和80：1时均明显高于PBS组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：Ct E型MOMP21-387融合蛋白具有良好的免疫原性，为基于MOMP21-387的Ct的ELISA法检测方法的开发和疫苗研究奠定了基础。
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沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位重组DNA诱导小鼠体液免疫有效剂量的探讨
目的:探讨沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位(Ct MOMP168)重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/Ct MOMP168免疫小鼠的有效免疫剂量,为体内免疫学效应的研究提供实验依据.方法:在重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/Ct MOMP168构建成功的基础上,抽提纯化质粒,分3个免疫剂量组,即50、100和150μg剂量组,同时设PBS对照组.肌肉注射免疫BALB/c小鼠3次,间隔2周,于免疫的0、2、4、6、8周分别尾静脉取血,分离血清,间接ELISA法检测小鼠血清中Ct MOMP多表位特异性抗体IgG的生成量,并于0、1、3、5、7周取小鼠阴道冲洗物,检测Ct MOMP多表位特异性SIgA的生成量,分别进行统计学分析.结果:3个不同免疫剂量组,血清特异性抗体IgG生成量于免疫第4周后均开始随免疫时间延长而逐步增加,150μg剂量组抗体IgG的生成水平高于其他剂量组(P＜0.05).免疫小鼠阴道分泌物中特异性抗体SIgA生成较快,免疫开始后1周,150 μg剂量组SIgA的产生水平高于其他组,7周后SIgA开始下降,但150 μg剂量组抗体水平仍高于其他剂量组(P＜0.05).结论:重组质粒DNA免疫小鼠的特异性抗体生成显示了剂量依赖关系,高剂量(150μg)免疫组小鼠血清特异性抗体IgG和阴道分泌性特异性抗体SIgA生成水平优势显著.
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沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位免疫血清中和活性分析
目的 制备高效价E型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)168多表位特异性免疫血清并研究其免疫学特性.方法 纯化的Trx-his/Ct MOMP168融合蛋白经弗氏佐剂乳化后,小鼠背部皮下多点免疫注射,间隔2周后加强免疫,共3次,并分别于免疫前和每次免疫后2周取血,采用ELISA法检测血清融合蛋白和E型Ct全菌体特异性抗体水平及变化趋势,通过体外中和反应检测多表位特异性血清的免疫学特性.结果 小鼠用Ct MOMP168多表位融合蛋白全程免疫后产生了抗融合蛋白和E型Ct全菌体特异性抗体,ELISA法检测高滴度达1:500.ELISA和体外中和实验检测结果显示,该抗体能特异性识别MOMP 多表位蛋白和E型Ct全菌体,并能有效抑制E型Ct感染Hela229细胞.结论 沙眼衣原体MOMP多表位融合蛋白免疫血清可特异性结合并中和E型Ct.
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沙眼衣原体主要外膜蛋白生物信息学分析
目的:分析和预测E血清型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)的结构和功能.方法:采用计算机辅助生物软件和网络数据库,从SwissProt蛋白质数据库中检索MOMP氨基酸序列,用Expasy服务器分析预测MOMP蛋白理化性质、二级结构,同时用Pcons服务器分析模拟蛋白质空间结构.结果:分析显示,Ct MOMP蛋白为一跨膜16次的酸性蛋白质,其空间结构为β-桶状膜蛋白,推测其功能为孔蛋白.结论:通过对MOMP生物信息学分析获得该蛋白的特性,为进一步研究Ct的感染与发病机制、研制Ct 亚单位疫苗以及研究MOMP新的功能域等提供理论依据.
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电泳和免疫印迹分析副溶血弧菌和溶藻弧菌主要外膜蛋白和多糖抗原
目的考察副溶血弧菌和溶藻弧菌的主要外膜蛋白(MOMP)及其多糖抗原(PSA)在不同菌株间的结构特征及其免疫学特性,从而进一步揭示其共同的保护性抗原.方法一步超速离心法和蛋白酶K消化法分别制备10株副溶血弧菌和7株溶藻弧菌的MOMP和PSA,SDS-PAGE和免疫印迹分析其结构特点.结果两种细菌的MOMP和PSA的结构和形态菌株间差别明显,但也有MOMP一致的菌株,免疫印迹显示,全部的10株副溶血弧菌和5株溶藻弧菌都具有分子量约为36kD的主要外膜蛋白,他们能够被副溶血弧菌全菌抗血清所识别,是两种细菌共同的具有强免疫原性的主要抗原.PSA分析未见经典LPS的O侧链结构.多糖成份在菌株间的交叉反应有限,可能受弧菌自身表面抗原复杂性的影响,凝集反应结果与免疫印迹试验结果不完全一致.此外,副溶血弧菌与溶藻弧菌的PSA也会产生免疫学上的交叉反应.结论 36 kD的MOMP是广泛存在于副溶血弧菌和溶藻弧菌的高丰度蛋白;与主要外膜蛋白相比,多糖抗原在菌株间具有更大的异质性;副溶血弧菌和溶藻弧菌的MOMP可能比PSA更具研制疫苗潜力.
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鹦鹉热嗜衣原体两对荧光定量PCR引物的应用与比较
针对鹦鹉热嗜衣原体(Cps)的主要外膜蛋白(MOMP)基因和多形态膜蛋白(PMP)基因分别设计引物,建立荧光定量PCR方法,比较两对引物的灵敏度和特异性.试验结果表明,两对引物均可用于Cps检测,在样本中靶标浓度高时,PMP引物的检测灵敏度优于MOMP引物;但前者的扩增效率低于后者,后者更适合用于Cps的实时定量PCR检测.相对定量研究表明国内不同Cps流行株的PMP基因在基因组上的拷贝数可能存在较大差异.
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沙眼衣原体MOMP基因真核表达载体免疫小鼠的研究
目的用pcDNA3-MOMP真核表达质粒直接免疫小鼠,观察小鼠对沙眼衣原体MOMP基因疫苗的免疫应答.方法大量制备重组质粒pcDNA3-MOMP,给小鼠肌肉注射,每3周免疫1次,共免疫3次.用微量免疫荧光及MTT法检测小鼠血清抗体及脾细胞对沙眼衣原体的特异性增殖反应.结果初次免疫接种后小鼠血清中检测出特异性抗体,加强免疫后抗体水平明显上升,免疫荧光滴度高达1∶256.脾细胞对沙眼衣原体的刺激指数明显高于对照组(P＜0.01).结论 pcDNA3-MOMP在小鼠体内既可诱导体液免疫应答,又可诱导特异性细胞免疫应答.
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沙眼衣原体L2型MOMP基因真核表达载体的构建及序列分析
目的构建携带沙眼衣原体L2型主要外膜蛋白(MOMP)基因的真核表达载体，为沙眼衣原体的DNA疫苗的研究提供材料。方法用PCR技术扩增L2型沙眼衣原体MOMP基因片段，再将其定向插入到真核表达载体pcDNA3多克隆位点中，构建成重组表达质粒。并用酶切分析、PCR扩增及部分序列测定等方法对重组质粒进行了鉴定。结果 MOMP基因被正确地克隆到真核表达载体pcDNA3中。测序结果同文献报道的序列一致。结论真核细胞表达载体pcDNA3-MOMP的成功构建，为进一步开展沙眼衣原体的DNA疫苗的研究奠定了基础。
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pEGFP/MOMP真核表达重组体的构建及表达
目的:克隆沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因,构建pEGFP/MOMP真核表达重组质粒,为沙眼衣原体核酸疫苗的研制提供依据.方法:用PGR方法从D型Ct基因组中扩增MOMP全基因片段,克隆入真核表达载体pEGFP相应的酶切位点中,阳性重组子经BamH I、Kpn I双酶切、PCR扩增及测序鉴定;并经脂质体介导转染HeLa细胞,36 h后观察瞬时表达情况.结果:PCR扩增得到约1.2kb的特异性MOMP基因片段;序列测定证实与GenBank登录的D型沙眼衣原体一致;筛选鉴定出真核表达重组体pEGFP/MOMP.结论:成功地构建了pEGFP/MOMP真核表达重组体,并在HeLa细胞中表达了MOMP.
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Guillain-Barré综合征患者空肠弯曲菌的主要外膜蛋白基因的分子分型
目的：研究空肠弯曲菌(Cj)的主要外膜蛋白(momp)基因的分子分型。方法：采用PCR方法对163株空肠弯曲菌的主要外膜蛋白基因进行扩增，用HindⅢ，HaeⅢ，MboⅡ和HhaI四种内切酶消化后进行电泳分析，并与热稳定性血清型(HS)和鞭毛蛋白A基因(flagellin A gene，fal A)分型方法相比较。结果：共观察到8种不同的主要外膜蛋白的限制性片段长度多态性的基因型，其中主要外膜蛋白基因-3(momp-3)占61％。Guillain-Barré综合征(GBS)和腹泻患者所有34株HS-19:Cj(fla)-1菌株均属同一个单一基因型，即主要外膜蛋白基因-1(momp-1)。结论：HS-19：Cj(fla)-1:momp-1菌株是空肠弯曲菌的一个特殊类型，与HS-19相关的GBS可能是阐明GBS发病机制好的模型。
关键词： Cuillain-Barré综合征 空肠弯曲菌 PCR 主要外膜蛋白 基因 -
穿透支原体主要外膜蛋白pET20b(+)/p35重组载体的构建、表达及鉴定
目的构建高表达且稳定的pET20b(+)/p35重载体,能在其中进行诱导高表达并得到纯化的p35蛋白.方法运用Blast、Pfam等生物信息学手段对穿透支原体(Mpe)p35基因序列结构与功能预测,将p35基因全长插入原核表达载体pET20b(+)中,在BL21StarTM(DE3)进行诱导表达、用Ni柱纯化,在GSH-GSSH体系中逐渐降低其变性剂的方法复性蛋白,Western-blot进行鉴定.结果成功的构建了pET20b(+)/p35重组载体,并能在宿主菌中较高表达;此蛋白以包涵体的形式进行表达.结论得到了纯化的p35蛋白,为进一步研究其生物学功能及其空间结构奠定了基础.
