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沙眼衣原体E型MOMP基因原核表达载体的构建和纯化
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)共有19个血清型,其中D～K血清型则可通过性传播,引起人类泌尿生殖道感染,并可引起并发症.沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)携带Ct亚型等多种抗原决定簇,是诊断试剂和疫苗开发的基础.本研究选择MOMP基因作为研究对象,用PCR技术扩增E型沙眼衣原体MOMP基因片段,再将其定位插入到原核表达载体pGEX中,构建重组表达质粒.然后将重组表达质粒转化人大肠杆菌(BL-21)中,并用酶切分析、PCR扩增及部分序列测定等方法对重组质粒进行鉴定.诱导表达,用SDS-PAGE及蛋白印迹进行鉴定,并以亲和层析柱纯化表达产物,为进一步研究该蛋白的生物学特性,了解衣原体的致病机制奠定基础.
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鹦鹉热嗜衣原体实时定量PCR检测方法的建立
目的 建立一种简便、快速、特异的荧光定量PCR检测方法,用于鹦鹉热嗜衣原体的快速检测.方法 以主要外膜蛋白(MOMP)基因为靶序列设计特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机渗入法建立实时定量PCR检测方法.结果 循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×102 -1.0×107拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.989.该方法用于鹦鹉热嗜衣原体的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍.结论 本研究建立的检测鹦鹉热嗜衣原体的实时定量PCR检测方法具有很高的特异性和敏感性,可以用于鹦鹉热嗜衣原体的检测.
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一种基于momp基因的衣原体分子生物学甄别技术的初步建立
目的利用PCR方法建立一种基于momp基因的衣原体分子甄别方法.方法根据衣原体momp基因的恒定区和可变区分别设计衣原体科特异性引物和种特异性引物,利用PCR方法对本实验室保存的衣原体进行扩增,以达到甄别的目的.利用限制性片段长度多态性(RFLP)分析科特异性PCR扩增产物,研究momp基因的多态性.结果利用建立的PCR方法对本实验室保存的九株衣原体进行了研究,结果表明八株衣原体都是鹦鹉热嗜衣原体,一株为沙眼衣原体.利用限制性片段长度多态性(RFLP)分析科特异性PCR扩增产物,分析了D34、B11001、CW2和CP12四株衣原体,结果可以产生两种不同的带型.结论利用建立的PCR方法可以达到检测甄别衣原体的目的,并可以通过RFLP分析衣原体的侵袭性.
关键词： 衣原体 MOMP基因 半套式PCR 限制性片段长度多态性 -
嗜肺军团菌momp基因疫苗的制备及其免疫原性研究
目的 构建真核重组质粒GFP-momp作为核酸疫苗,已构建的原核重组质粒pET-momp表达的蛋白作为蛋白疫苗,二者联合免疫BALB/c雌性小鼠,观察其免疫原性.方法 (1)以嗜肺军团菌DNA作为模板,扩增得到momp基因,并克隆至pEGFP-C1载体获得重组质粒GFP-momp.鉴定正确后,将其转染到NIH3T3细胞,利用荧光显微镜观察GFP-momp的表达.(2)选取BALB/c雌性小鼠60只,平均分为4组,即磷酸盐缓冲液(PBS)组(A组)、空质粒pEGFP-C1组(B组)、DNA疫苗组(C组)、联合疫苗组(D组).以重组质粒GFP-momp作为DNA疫苗,重组质粒GFP-momp和MOMP蛋白作为联合疫苗,第1天A组肌肉注射PBS 50tμL,B组注射pEGFP-C1 50 μg,C、D组各注射GFP-momp 50 μg;第14天各组以相同剂量追加免疫1次;第21天A、B、C组用相同剂量再追加免疫1次,D组注射10 μg纯化的MOMP蛋白.借助对各试验组小鼠的抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性等指标的动态检测,来评价DNA疫苗与蛋白疫苗的免疫原性.结果 扩增出831 bp的momp基因,构建重组质粒GFP-momp,转染入NIH3T3细胞并在细胞内表达出绿色荧光蛋白.在淋巴细胞增殖试验中:A组和B组比较差异无统计学意义(P＞0.05);C组和D组淋巴细胞增殖活性均高于B组,差异有统计学意义(P＜0.05);C组高于D组,差异有统计学意义(P＜0.05).间接ELISA测定血清中抗原特异性抗体水平结果显示,A、B两组比较差异无统计学意义(P＞0.05);C、D两组均高于B组,差异有统计学意义(P＜0.05);D组抗体滴度高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05).CTL杀伤活性试验结果显示,A、B两组比较差异无统计学意义(P＞0.05);C、D两组均高于B组,差异有统计学意义(P＜0.05);D组杀伤活性高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建momp基因的真核表达载体并在NIH3T3细胞中得到表达,并进一步得出嗜肺军团菌momp基因诱导产生的DNA疫苗和DNA-蛋白疫苗均能产生细胞免疫和体液免疫,具有免疫原性.
