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EvaGreen多重荧光RT-PCR结合熔解曲线分析同时检测3种呼吸道病毒
目的 建立能同时检测甲型流感病毒 (Flu-A) 、乙型流感病毒 (Flu-B) 和鼻病毒 (HRV) 的Eva Green多重荧光RT-RCR熔解曲线分析方法.方法 针对Flu-A的M基因、Flu-B的NS1基因、HRV的5'NCR设计检测引物, 并使3个基因扩增产物的解链温度 (Tm值) 相差≥1.5℃.采用Eva Green新型荧光染料, 通过优化反应条件建立一步法多重RT-PCR反应体系.通过与商品化的荧光RT-PCR试剂盒的对照试验, 对新建方法进行性能验证.结果 3种病毒的PCR产物均获得特异性的熔解曲线峰, Tm值范围分别为:Flu-A, 85.085.5℃;Flu-B, 82.583.0℃;HRV, 88.589.5℃, 可以通过Tm值差异明显区分3种病毒.100份临床样本的性能验证显示, 新方法对3种病毒的检测均有较高的灵敏度、特异性和检验效能.结论 针对3种常见呼吸道病毒建立了基于Eva Green结合熔解曲线分析的多重荧光RT-PCR方法.该方法简便实用、成本低廉, 为喘息性疾病的临床诊断和病原谱研究奠定了方法学基础.
关键词： EvaGreen染料 多重荧光RT-PCR 熔解曲线 呼吸道病毒 -
采用熔解曲线分析法检测红细胞Duffy血型抗原Fy-a/b基因型
本研究建立用于红细胞Duffy血型抗原Fy-a/b基因分型的熔解曲线分析方法.根据β-actin和Fy-a/bmRNA序列设计并合成引物,建立实时荧光多重PCR-熔解曲线分析法,并用该方法与常规PCR-SSP法同时检测中国成都地区198名献血者Duffy血型抗原Fy-a/b的基因型.结果表明,熔解曲线分析法和常规PCR-SSP法的基因分型结果完全一致.198名中国成都地区献血者中Fya(+)178例(89.9％),Fya(+)Fyb(+)杂合子19例(9.6％),Fyb(+)1例(0.5％),Fy4基因频率0.947,Fyb基因频率0.053,符合中国人Duffy血型分布特点.结论:本研究成功建立了红细胞Duffy血型抗原Fy-a/b基因分型的熔解曲线分析方法,该方法适用于大规模Duffy血型基因分型.中国成都地区的献血者Duffy血型基因以Fya为主.
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染料法实时荧光PCR检测慢性乙型重型肝炎患者外周血克隆特异性αβT淋巴细胞
以染料法(SYBR Green I)实时荧光PCR并结合基因熔解曲线峰形来监测慢性乙型重型肝炎(慢乙重肝)患者(健康献血者为对照)外周血T细胞受体B链基因(TCRBV)克隆特异性扩增情况,从而可能反映慢乙重肝患者对HBV感染的免疫应答状态.
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荧光杂交探针实时聚合酶链式反应快速检测甘露聚糖结合凝集素启动子区基因变异方法的建立
目的 建立用荧光杂交探针实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测人甘露聚糖结合凝集素(MBL)启动子区基因变异新型的基因分型法--Tm基因分型法.方法 收集30例健康献血员外周抗凝全血,提取基因组DNA.通过Light Cycler实时PCR仪描绘扩增的目标DNA片段的熔解曲线,根据熔解温度(Tm)峰值判定待测标本的基因变异类型.后,用基因测序法检测PCR产物来验证Tm基因分型法的准确性.结果 建立了新型的Tm基因分型法,且测定PCR产物的时间仅180 min,检测结果与测序法完全吻合.结论 Tm基因分型法检测人MBL启动子区基因变异快速、准确,重复性好,具有广泛的临床应用前景.
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SYBR Green Ⅰ聚合酶链反应检测人白细胞抗原-DRB1*12
目的建立一种人白细胞抗原(HLA)基因分型方法.方法用序列特异性引物和荧光染料SYBR GreenⅠ聚合酶链式反应(PCR)方法,对1份已知HLA-DRB1*12的标本和12份未知型别的临床标本进行HLA-DRB1*12位点检测和分型.结果 12份标本的扩增产物经熔解曲线分析,有3份标本为DRB1*12,产物用离心柱纯化后,直接进行DNA测序,结果证实为DRB1*12阳性.结论 SYBR GreenⅠPCR 操作简便,结果准确,可成为一种HLA基因分型的新方法.
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实时荧光PCR结合探针熔解曲线检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性及其与肝硬化的相关性研究
聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)是当前常用的检测基因多态性的方法之一,该法不仅操作时间长,且在采用限制性内切酶对PCR产物进行酶切后,通常采用溴乙锭或银染的方法观察结果.溴乙锭严重危害人体健康,而银染试剂相当不稳定.因此有必要建立一种快速且对人体危害性较低的多态性检测方法.实时荧光聚合酶链反应(PCR)是一种将先进的光学技术、温控技术、荧光素标记技术以及计算机软件有机结合的新型PCR,能够对PCR每一个循环的荧光强度进行监测,故称为实时荧光PCR.双探针杂交技术是一种重要的实时荧光PCR技术,通常用于基因的定量检测,但是如果结合探针熔解曲线则可用于基因多态性和突变的检测[1-3].
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SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测西尼罗病毒
目的 建立快速、敏感和特异的检测西尼罗病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 法,用于西尼罗病毒(WNV)疾病的早期诊断.方法 采用RT-PCR扩增WNV 基因片段,将其克隆至T载体,重组质粒测序并进行同源性分析;阳性质粒用于替代WNV,以阳性质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测.结果 经测序证实扩增片段属于WNV,所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法可检测到10拷贝的西尼罗病毒RNA,而对其他黄病毒科成员日本脑炎病毒及登革热病毒的检测则为阴性,表明该方法特异.结论 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 简便快速,具有较高的敏感性和特异性,可以成为一种早期检测西尼罗病毒的新方法.
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应用高分辨熔解曲线分析方法检测β-地中海贫血纯合突变
目的 探讨高分辨熔解曲线分析方法(HRM)检测β-地中海贫血纯合突变的有效性.方法 应用HRM方法对中国常见的4种β-地中海贫血(4个IVS-Ⅱ-654即HBB:c.316-197C>T,3个Codons 41/42即HBB.c.126-129 delCTTT,1个Codon 17即HBB.c.52A>T和4个-28即HBB:C.-78A>G)纯合突变进行检测,通过直接检测和与野生型标本混合后再检测2种方法检测.结果 HRM方法可以检测出中国常见的4种β-地中海贫血纯合突变.结论 HRM方法可以对ep国常见的4种β-地中海贫血纯合突变进行检测,在产前诊断上有很好的应用前景.
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厦门地区遗传性耳聋流行病学调查
目的：调查厦门地区遗传性耳聋的发生率及热点基因突变，探讨在厦门地区开展遗传性耳聋检测的必要性和意义。方法采集2015年12月至2016年2月厦门市中山医院就诊的132名耳聋患者唾液并提取DNA，应用探针熔解曲线技术检测4个常见耳聋基因的20个突变位点，包括GJB2(c.35delG, c.167delT, c.176-191del16bp, c.235delC, c.299-300delAT)、GJB3(c.538 C>T, c.547 G>A)、SLC26A4(c.749 T>C, c.754 T>C, c.919-2 A>G, c.1174 A>T, c.1226 G>A, c.1229 C>T, c.1707+5 G>A, c.1975 G>C, c.2027 T>A, c.2162 C>T, c.2168 A>G）和线粒体DNA 12S rRNA (m.1494 C>T, m.1555 A>G)。结果132名耳聋患者中，共检测出耳聋基因异常者42例（31.8%），其中22例携带GJB2基因突变，16例携带SLC26A4基因突变，4例携带线粒体基因m.1555A>G均质性突变。在这些基因异常的患者中，GJB2基因的c.235delC（15.9%，21/132）及SLC26A4基因的c.919-2A>G（10.6%，14/132）为厦门地区的两大热点突变。结论厦门地区耳聋患者中常见耳聋基因突变以GJB2基因突变、SLC26A4基因突变为主。因此，该地区应将遗传性耳聋检测纳入遗传咨询、产前诊断及新生儿筛查，尤其是新生儿药物性耳聋和PDS综合征等迟发性耳聋的基因检测，从而有效的降低耳聋的发生。
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TaqMan探针熔解曲线技术检测GJB2基因突变
目的：建立快速可靠的TaqMan探针熔解曲线技术，分析非综合征型遗传性耳聋患者的GJB2基因及探讨TaqMan探针熔解曲线技术。方法制备标准品，利用TaqMan探针基于荧光PCR熔解曲线平台建立熔解曲线分析技术；收集138例正常人群、113例非综合征型遗传性耳聋患者及2个非综合征型遗传性耳聋家系，应用TaqMan探针熔解曲线技术分析GJB2基因常见的35delG，176_191del16，235delC，299_300delAT的4个突变位点；结果利用直接测序技术加以验证。结果138例正常人群中检出2例GJB2基因突变，113例非综合征型遗传性耳聋患者中检出22例GJB2基因突变，2个耳聋家系先证者均为GJB2基因突变患者；所有检测结果均与测序结果一致。结论利用TaqMan探针建立了一种快速可靠的探针熔解曲线技术，经测序验证能准确的检测GJB2基因常见的4种突变。
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一种检测乙型肝炎病毒核心启动子区nt1758-1777缺失突变新方法的建立
目的 建立一种新的单管巢式实时荧光PCR熔解曲线法用于快速灵敏地筛检临床乙型肝炎病毒(HBV)样本核心启动子区nt1758-1777片段缺失突变.方法 通过比对分析GenBank收录的HBV基因序列,设计通用巢式PCR引物,建立优化方法体系;对340例慢性乙型肝炎患者血清HBV CP区进行扩增,产物直接测序,并随机选择50例样本进行克隆测序,分析nt1758-1777缺失突变检出率.野生型和缺失型标准质粒来自于单克隆测序样本,并对两种标准质粒及克隆检测样本进行荧光定量PCR扩增,获得熔解曲线及熔解温度,得到熔解曲线的阳性标准.用新建立的方法对340份样本进行检测,并用焦磷酸测序加以验证.结果 直接测序法检出16例(4.7％)阳性样本.标准质粒及克隆检测样本中缺失序列比例≥15％的样品,其熔解温度(Tm)≥88.3℃,遂将≥88.3℃作为新方法的阳性标准.用新方法检出47例(13.8％)阳性样本,其中用焦磷酸测序验证缺失突变比例≥1.0％的样本38例,＜1.0％的样本9例;15份阴性样本缺失突变比例均＜1.0％.用焦磷酸测序验证缺失突变比例1.0％作为阳性阈值,新方法对nt1758-1777缺失检测的阳性符合率为80.9％,阴性符合率为100％,两种方法的一致性Kappa值为0.671.结论 与直接测序法相比,新方法可显著提高nt1758-1777缺失检出率,结合焦磷酸测序证实,可有效提高检测的准确性和经济性.该方法对建立,BV其他缺失突变的检测方法也可提供借鉴.
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建立PCR-高分辨熔解分析法检测急性髓系白血病IDH1基因突变
可溶性异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)基因在细胞氧化损伤反应中发挥着重要的调控作用[1].2008年Parsons等[2]首先报道胶质瘤患者中12%IDH1转录本第395位碱基由鸟嘌呤突变为腺嘌呤(c.395G→A),导致该酶精氨酸被组氨酸所替代(R132H).其后发现IDH1基因突变还可见于星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性肿瘤等[3].高分辨率熔解(HRM)分析是近年来发展起来的一种新型的突变扫描和基因分型的遗传学分析方法.美国Idaho公司的LightScanner是以HRM技术为基础的分析仪,它采用新型饱和双链DNA结合饱和荧光染料LC Green,通过分析PCR扩增产物解链过程中熔解曲线的变化来检测单碱基突变、小片段插入或缺失[4],具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点,已越来越多地被用于单核苷酸多态性分析(SNP)和基因突变扫描.
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浅谈高分辨率熔解曲线快速鉴定侵袭性真菌的发展
侵袭性真菌感染指真菌侵入人体组织、器官或血液中生长繁殖,导致炎症反应和组织器官损伤的病理生理过程.随着社会老龄化、抗生素的滥用、激素及免疫抑制剂的长期使用、骨髓及器官移植的广泛开展、侵入性治疗手段的不断增多和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的流行,侵袭性真菌感染(IFI)的发病率正在迅速增长,严重威胁人类的健康与生命安全,已成为住院患者感染及死亡的主要原因之一[1].因此,准确且快速地鉴定侵袭性真菌对降低住院患者感染及死亡具有重要意义.
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分子信标用于活细胞内源性mRNA检测的实验研究
目的:观察分子信标(molecular beacons,MB)在活细胞内及在体水平对内源性mRNA检测的可行性.方法:合成增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)的MB,模拟体内条件,分别从MB的稳定性、与目标基因结合的特异性和敏感性进行检测,并通过在活细胞和斑马鱼胚胎内的应用来观察其对内外源性mRNA的检测的可行性.结果:MB在37℃条件下在体外48小时内经琼脂糖凝胶电泳鉴定未见降解,熔解曲线结果显示荧光强度差异无统计学意义(P＞0.05);并且只有在靶序列存在的条件下MB的信号强度显著增强,MB的信号强度与靶基因浓度呈正相关并能基本稳定存在;经eGFP和靶向eGFP的MB共转染的293T细胞能看到荧光表达,靶向eGFP的MB可特异性结合细胞内eGFP的mRNA;在单细胞期斑马鱼胚胎内共注射MB以及目标单链后能观察到荧光表达.结论:结果表明分子信标可用于活细胞内内源性mRNA的检测.
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高分辨率熔解曲线及其在分子诊断中的应用
通过加热使双链DNA解离为单链是DNA基本特性之一,高分辨率熔解曲线( high resolution melting,HRM)正是基于这一特性,采用荧光饱和染料监测熔链过程,从而获得DNA上的相关信息,例如突变、单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism,SNP)等.由于其快速、高通量、低 成本,已越来越多应用于临床疾病的分子诊断与分型.
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一起聚集性腺病毒暴发疫情的调查及病原学分析
目的 对一起流感样暴发疫情进行流行病学调查和病原学检测,对毒株进行分子流行病学分析,为呼吸道传染病暴发疫情的处置提供依据.方法 对暴发疫情进行流行病学调查,收集病例咽拭子样本,采用RespiFinder 2SMART多病原检测试剂盒进行熔解曲线分析,筛查致病原,并以qPCR法确认.用Hep-2细胞分离病毒,提取毒株核酸进行PCR扩增并进行序列分析,NCBI核酸数据库进行序列比对,确定型别.结果 疫情累计发病17例,仅涉及一个班级,班级罹患率43.6％,男女比1.8∶1,疫情持续11 d.主要症状为发热(17例,100.0％)、咳嗽(16例,94.1％)等.采集10例病例咽拭子,5份以多病原检测试剂盒进行熔解曲线分析,检出2例为腺病毒(ADV)核酸阳性,其余5份经qPCR检测,3份为ADV核酸阳性.以Hep-2细胞分离5份ADV核酸阳性标本,成功分离4株毒株,对其进行DNA测序,NCBI核酸数据库进行Blast序列比对,结果显示其六邻体保守区核酸与ADV3型核酸同源性为97％.结论 该暴发是一起由ADV3型引起的暴发疫情.
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实验条件对荧光共振能量转移的探针熔解曲线影响
目的探讨基于荧光共振能量转移的杂交探针熔解曲线的实验影响因素,优化此法检测基因的实验条件.方法利用荧光共振能量转移的原理,设计检测人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因的荧光杂交探针,在熔解曲线模式下,设定不同模板量、Mg2+浓度,观察熔解曲线峰面积及其Tm值.结果在设定的反应体系中,随着模板量从10 ng渐次上升至100 ng,熔解曲线峰面积亦逐渐增大;随着Mg2+终浓度的增加,峰面积也增加,而且熔解曲线的Tm值也呈升高趋势.结论探针熔解曲线法准确、迅速、操作简单,在应用中应考虑到模板量及Mg2+浓度的影响以便获得理想的结果.
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PCR熔解曲线法检测乙型肝炎病毒变异株
目的探讨PCR熔解曲线法检测HBV DNA聚合酶活性区YMDD变异的临床应用价值,并以DNA测序结果为标准,比较其敏感性和特异性.方法采用DNA测序法和PCR熔解曲线法,对拉米夫定抗病毒治疗过程中出现HBV DNA由阴转阳的68例慢性乙型肝炎患者的血清,同步进行YMDD变异株的检测.结果68例患者血清中,用DNA测序法检出YMDD变异株55例,其中YIDD变异25例(其中11例伴有L528M变异)、YVDD变异24例(其中伴有L528M变异19例)、YMDD与YVDD共生伴有L528M变异1例、YMDD与YIDD共生伴有L528M变异5例,有13例未发生YMDD变异(野生型).用PCR熔解曲线法检出YMDD变异株52例,其中YIDD变异28例、YVDD变异21例、YMDD与YVDD共生1例、YMDD与YIDD共生2例.有10例未发生YMDD变异(野生型),阴性结果6例.两法变异符合率为93.88%(46/49);检出符合率为91.18%(62/68).结论采用PCR熔解曲线法进行YMDD变异株的检测,其操作方法简便,省时,不易交叉污染,很适用于临床快速诊断和人群筛查.但该法的敏感度和特异性均不如DNA测序法.
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Sybr greenⅠ实时定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的探讨
目的选择以Sybr greenⅠ作为荧光指示剂做实时PCR(SYBR法),检测乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)DNA,并与国产TaqMan荧光实时定量PCR方法比较.方法对189例临床血清标本DNA分别进行常规PCR和Sybr greenⅠ荧光PCR检测.结果使用国产TaqMan荧光实时定量PCR方法测得106例HBV DNA阳性,67例阴性,16例判断困难.使用Sybr greenⅠ实时定量PCR方法测得117例HBV DNA阳性,72例阴性,使用Sybr greenⅠ实时定量PCR方法测得HBVDNA阳性熔解曲线Tm值为83.67±0.95℃.其中106例阳性和67例阴性与使用国产TaqMan荧光实时定量PCR方法所测阴阳性一致,二者定量的回归系数为0.941.使用国产TaqMan荧光实时定量PCR方法判断困难的16例中,11例Sybr greenⅠ实时定量PCR方法判断为阳性,但定量拷贝数很低,其中大值为1.68×103拷贝/ml,小值为4.37×102拷贝/ml,平均值为839拷贝/ml;另5例判断为阴性.结论使用SybrgreenⅠ荧光素进行实时定量PCR检测HBV DNA的敏感度要高于国产TaqMan的荧光实时定量PCR方法,能够适合目前临床上及时有效准确检测标本的要求.
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RNA恒温扩增联合熔解曲线分析鉴定胞内分枝杆菌的应用研究
目的 建立RNA恒温扩增联合熔解曲线分析技术(RIARD-MCA)鉴定胞内分枝杆菌的方法,评估其应用效果.方法 以胞内分枝杆菌的16S rRNA的特异序列为检测靶标设计RNA探针和带有T7启动子的逆转录扩增引物,42 ℃恒温扩增实时检测后进行熔解曲线分析,对21种分枝杆菌标准株、5种非分枝杆菌和229株分枝杆菌临床分离株进行鉴别检测;同时以16S rRNA及hsp65基因PCR测序结果为金标准对照.结果 RIARD-MCA在21种分枝杆菌标准株及5种非分枝杆菌检测中只有胞内分枝杆菌阳性,其他阴性,与测序结果一致;在分枝杆菌临床分离株检测中,鉴定胞内分枝杆菌63株,其余为非胞内分枝杆菌,PCR测序为胞内分枝杆菌63株,其余166株为非胞内分枝杆菌,其灵敏度为100%(63/63),特异度为100%(166/166).结论 RIARD-MCA鉴定胞内分枝杆菌具有较高的灵敏度、特异度和准确性,且检测快速,有望作为一种新的胞内分枝杆菌临床分离株鉴定方法.
