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Has-miR-204的生物学信息分析及研究进展
MicroRNA(miRNA)是一类由 21 ~ 25 个核苷酸组成的非编码蛋白质的单链小分子 RNA,它们广泛存在于真核生物中,在物种进化中相当保守,其表达具有组织特异性和阶段特异性.miRNA 基因通常位于基因间或内含子区域,在核内由 RNA 聚合酶 II 转录产生具有帽子结构多聚腺苷酸尾巴的初级 miRNA(primary miRNA,Pri-miRNA).
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抗汉坦病毒糖蛋白细胞内抗体的构建和稳定表达
目的在内质网和细胞质内表达抗汉坦病毒糖蛋白G1,G2细胞内抗体. 方法 PCR分别扩增抗汉坦病毒糖蛋白抗体VH和VL段基因,克隆入单链抗体表达载体pOPE-101-215(Yol),转化大肠埃希菌XLI-Blue,IPTG诱导表达并鉴定其活性,再将单链抗体基因克隆入真核表达载体pEF/myc/ER和pEF/myc/CYTO,转染Vero E6,使单链抗体在内质网和细胞质内得到表达;通过G418和有限稀释法筛选阳性克隆,建立稳定表达抗汉坦病毒糖蛋白细胞内抗体的细胞系.结果 Western-blot检测证实原核表达单链抗体,ELISA,IFA检测其具有抗原结合活性,真核表达显示内质网和细胞质内特异性荧光,筛选细胞系阳性率>95%.结论成功建立稳定表达抗汉坦病毒糖蛋白细胞内抗体的细胞系,为利用汉坦病毒细胞内抗体研究抗病毒作用和病毒的包装复制及病毒感染机制奠定良好基础.
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肝细胞癌病人中p53基因突变状况探讨
目的了解肿瘤抑制基因p53在肝细胞癌中的突变情况,探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染与p53基因突变之间的关系。方法 提取50例有乙型肝炎病毒感染史肝癌患者手术样本中的DNA,用聚合酶链式反应(PCR)扩增5~9外显子,作单链构象多态性(SSCP)分析。结果 p53基因突变率超过26%,突变主要分布于5~8外显子,5、6、7、8外显子分别有3、3、4、3例,另有4个可疑突变。结论p53基因突变可能是肝细胞癌的病因之一,而乙型肝炎病毒感染在中国肝癌患者p53基因突变中可能起到比较重要的作用。
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抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3单链抗体的制备及免疫组织化学研究
目的研制抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的人源噬菌体单链抗体,并探讨其在临床诊断中的应用价值。方法 以重组的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3为固相抗原,利用亲和筛选的原理,从噬菌体抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点免疫杂交试验和DNA序列分析,获得HCV NS3的人源单链抗体;用该抗体与不同来源的HCV NS3抗原进行反应;对10例石蜡包埋的丙型肝炎患者肝组织进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明,所制备的HCV NS3人源单链抗体能与不同来源的HCV NS3抗原特异性结合(吸光度A值为1.38);免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别丙型肝炎患者肝组织HCV NS3抗原,与正常肝组织及乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原均无交叉反应。结论 此法制备的单链抗体亲和性好,特异性强,且制备方法简便,周期短,可用于HCV NS3病原的检测。
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用噬菌体抗体库分离NK细胞抑制受体特异性的ScFv片段
目的 探讨从噬菌体抗体库分离杀伤细胞抑制受体(KIRs)特异性ScFv(singlechain Fv)的可行性及其特征.方法 所用KIR为NKAT2,其可溶性形式为NKAT2-IgG1.噬菌体抗体库为Nissim等报道的半合成抗体库.抗体库经包被免疫管的NKAT2-IgG1 5次筛选后,可溶性ScFv由IPTG诱导细菌而获得,筛选效果由测定噬菌体的菌落形成单位及DNA酶切图谱分析.ELISA、聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹分析ScFv特异性及免疫学特征,并进行DNA的序列测定.结果 5次筛选后,噬菌体得到200倍的富集,酶切图谱也显示某种构型噬菌体的富集.40个克隆的细菌上清经测试,37个显示与NKAT2有较强的反应.ScFv经聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹显示相对分子质量为30×103,其DNA序列完全相同,重链CDR3区编码氨基酸为ESNLVTC,重链其它部分与DP35一致.结论 研究初步结果表明,用噬菌体抗体库可以快速、简便地产生用于KIR研究的较高特异性的试剂.
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人源性汉坦病毒噬菌体抗体基因的筛选、测序和表达
目的 为了获取人源性HFRS基因工程抗体.方法 直接从人体PBL构建人全套ScFv、VH噬菌体表面呈现文库,以panning方法筛至四级文库,以ELISA方法鉴定各克隆抗汉坦病毒活性.结果 获得了14个ScFv阳性克隆和11个VH阳性克隆.其中ScFv高阳性克隆A410值为0.44, VH高阳性克隆A410值为0.50.对高阳性克隆进行了测序分析,证明连接和克隆正确,获得了抗HTV人源性ScFv和VH抗体的基因片段.克隆再转化于HB2151 菌株,成功地进行了分泌型抗体片段的表达.结论 采用噬菌体抗体库技术直接从人体克隆人源性汉坦病毒噬菌体抗体可行,对HFRS的防治有一定的实际意义.
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小分子单链RNA与胃癌的研究进展
肿瘤的预防、早期诊断和治疗一直是人类难以攻克的难题.胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,据估计每年有超过90万的新确诊病例和大约70万的胃癌患者死亡,居肿瘤死亡病因的第二位[1],死亡的肿瘤患者中有90%已发生了转移[2].
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miRNA检测技术进展及其在医学检验中的应用
miRNA是一类21~23个核苷酸左右的非编码单链小RNA,首先由Lee等[1]于1993年在秀丽线虫中发现.Reinhart 等[2]于2000年发现miRNA具有控制线虫发育的重要功能.随后,miRNA成为医学研究的热点之一.
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IL-12细胞因子家族的新成员——IL-35
IL-35是新发现的IL-12细胞因子家族成员,由两个亚基组成的异二聚体,即EBI3和IL-12p35.EBI3由EB病毒感染的B淋巴细胞诱导产生,是编码为34 kDa的糖蛋白,27%的氨基酸与IL-12p40相同;IL-12p35与其他单链细胞因子如IL-6同源.1997年Devergne等发现EBI3和IL-12p35可以聚合为新的造血因子,且在体内形成异二聚体,但未对其功能进行研究.
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利用适配子抗病毒性肝炎的新型治疗策略
适配子(aptamer)指能与靶分子以高亲和力结合的配基,是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术,从人工合成的大容量单链随机寡核苷酸文库中通过反复"与靶分子作用-筛选-富集"过程而获得.
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微小RNA-221/222在神经胶质瘤中的研究进展
微小RNA(microRNA或miRNA)是长度为21~25个核苷酸的短序列、非编码、具有调控功能的单链小分子RNA.miRNA能在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和(或)抑制其翻译过程从而发挥负调控基因表达的过程[1].miRNA221/222是miRNA家族中的一个重要组成部分.
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单倍体相合造血干细胞移植
目前,异基因造血干细胞移植(allo-HSCT),已成为治疗多种血液及非血液系统疾病主要手段之一.对于那些没有HLA完全相合供者的患者单倍体相合造血干细胞移植(haploidentical hematopoietic stem cell transplantation)不失为一种好方法.什么是单倍体相合?人体细胞都是二倍体细胞(为双链DNA),只有生殖细胞为单倍体(为单链DNA).
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与肿瘤侵袭转移相关的微小RNA研究进展
微小RNA(microRNA)是一类全长为19~25 nt的非编码单链小分子RNA,通过与靶基因3'端非翻译区(3'UTR)结合,降解mRNA或抑制其翻译,从而调控靶基因的表达[1].从1993年Lee等[2] 发现lin-4的小RNA,并命名为微小RNA以来,目前已发现500多种微小RNA作用于人体内,它们与细胞周期的调控、细胞分化和凋亡有密切联系.
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用Red介导的同源重组结合酶切改构质粒DNA
目的:用Red介导的单链寡核苷酸体内同源重组结合限制酶切方法对pBR322-Red质粒中的DNA序列进行精确的缺失突变.方法:用合成的单链寡核苷酸打靶分子电击转化W3110(pBR322-Red)宿主菌,利用Red提供的同源重组功能敲除从kil基因至N基因长约2 100 bp的DNA序列,并用kil-N序列中含有的单一酶切位点XhoⅠ对混合质粒进行酶切,取酶切产物转化W3110感受态细胞,菌落PCR方法筛选重组阳性克隆.结果:在没有任何筛选标记的情况下,用菌落PCR方法从10个菌落中成功挑选出1个重组阳性克隆.结论:该方法操作简单、精确,能够避免引入新突变,为DNA序列的缺失突变提供了一种新方法.
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电鳐乙酰胆碱酯酶单链抗体基因的克隆及表达
目的欲用计算机模拟及分子对接技术揭示抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体3F3抑酶的分子基础,但3F3分子远大于乙酰胆碱酯酶(AChE),难以操作,故拟用其单链抗体为工具进行研究.本研究旨在设计、克隆并表达抗AChE单链抗体Sc3F3基因,推演重组单链抗体的氨基酸顺序,并证明纯化的重组单链抗体有抑制AChE的作用.方法使用分泌抗电鳐AChE单克隆抗体3F3(3F3Ab)的杂交瘤细胞提取总RNA.用RT-PCR技术扩增重链可变区(VH)cDNA及轻链可变区(VL)cDNA基因,通过连接肽(Gly4Ser)3基因将VH基因和VL基因连接,制成单链抗体基因(ScFv).将ScFv基因插入载体pCANTAB-5E用于表达.在大肠杆菌中表达的3F3单链抗体(Sc3F3)用Sephadex G75凝胶过滤和QAE-Sephadex A-50离子交换层析纯化.AChE与抗体的免疫反应性用ELISA法测定.AChE活性用微量羟胺比色法测定.结果测序结果证明所克隆的ScFv基因是功能重排基因, 长度为723 bp.重、轻链基因长度分别为357 bp和321 bp.ScFv基因(含连接肽基因)所编码的纯化的重组Sc3F3的分子量为31.6 ku.Sc3F3与AChE反应良好,但对AChE活性的抑制明显弱于3F3Ab.Sc3F3的抑制效力约为3F3Ab的1/10.结论在计算机模拟及分子对接研究中使用本研究设计的单链抗体Sc3F3应是可靠的.
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血清铜蓝蛋白测定在临床上的应用
铜蓝蛋白(CP)又称血蓝蛋白,铁氧化酶,是一种含铜具有氧化酶的单链α-2球蛋白[1],相对分子质量为132KD.每个分子含8个铜原子,含铜量为0.34%,血清中约95%的铜与α-2球蛋白结合成铜蓝蛋白,起调节铁吸收和运输作用,正常人血浆中含量平均为3mg/L.
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微RNA和心血管疾病的研究进展
微RNA(microRNA,miRNA)是一类长度很短的非编码蛋白质的单链小分子RNA,广泛存在于多细胞生物和病毒体内,是一种起负调控作用的分子,主要通过核酸序列互补匹配结合到特定的靶mRNA上,抑制靶mRNA翻译过程或降解靶mRNA.目前越来越多的研究结果显示,miRNA的表达及功能失调可能导致心血管疾病的发生.现将对这方面的新研究进展综述如下.
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microRNA与心律失常的研究进展
microRNA (miRNA)是Lee于1993年和Reinhart等于2000年在研究线虫的发育调控过程中发现的小分子RNA,广泛存在于植物、线虫及人类的细胞中,其由一系列长21~25个核苷酸单链RNA分子构成,是非编码小分子RNA.多种miRNA在同一细胞的表达使得细胞处在一种内在的miRNA环境中,这个环境控制着成千上万编码基因mRNA水平,使得各种蛋白表达处在一个适合的水平[1].
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微小RNA在免疫系统和类风湿关节炎中的作用
微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长约21~25个核苷酸的非编码单链小RNA,其在不同类型免疫细胞的分化发育、固有免疫、适应性免疫及炎症因子的信号转导过程中起着重要的调节作用,参与自身免疫性疾病及炎症性疾病的发病过程,现就miRNA在免疫系统中的作用和参与类风湿关节炎(rheumatoid arthfitis,RA)发病过程作一综述.
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miRNA分析及其在糖尿病肾病研究中的应用进展
miRNA(microRNA,miR)是一类长度约为19~25个核苷酸(nt)的非编码调控单链小分子RNA,由一段具有茎环结构的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切后生成;其基因绝大部分定位于基因间隔区,转录独立于其他基因,并不翻译成蛋白质.miRNA通过与其靶分子信使RNA(mRNA)的3'端非编码区域(3'-untranslated region,3'UTR)互补匹配并导致mRNA翻译受抑制,参与多种病理过程[1].目前在美国40%的终末期肾病由糖尿病肾病(DN)引起,DN已成为终末期肾病的首要原因;在中国DN已是终末期肾病的第二位病因且发病率有上升趋势.miaRNA作为一种非蛋白质的新型基因表达调控因子在DN的发生发展中具有重要作用并有可能成为新的治疗靶点,为疾病提供新的治疗策略.本文就miRNA分析在DN中的应用进展做一综述.