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利用CRISPR/Cas9技术高效建立FUS-GFP荧光报告细胞系
利用CRISPR/Cas9基因敲入技术建立稳定表达FUS(fused in sarcoma)的细胞系.方法:扩增FUS 5''arm序列,puro-T2A-GFP报告基因,FUS 3''arm序列,将3个片段一次连接至目的载体上.制作长链ssDNA做为同源重组模板.将FUS agRNA,cas9,ssDNA共转染hela和hct116细胞,通过细胞同源重组修复途径,实现报告基因GFP的敲入,嘌呤霉素筛选阳性细胞,流式分选纯化和富集带有绿色荧光的细胞,建立表达FUS-GFP融合蛋白的细胞系.结果:成功构建了带有FUS 5''arm+puro-T2A-GFP+FUS 3''arm的靶向载体质粒.琼脂糖凝胶显示ssDNA的成功产生.共聚焦显微镜显示转染后药筛48小时的hela和hct116细胞均出现绿色荧光.流式分选显示,带有绿色荧光的细胞比例约为30％-40％.结论:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了FUS-GFP荧光报告细胞系.
关键词： CRISPR/Cas9 knockin 同源重组 ssDNA FUS -
基因敲除技术在结核病研究中的应用
1989年,美国科学家Capecchi通过研究胚胎干细胞同源重组原理获得的基因敲除小鼠取得成功,因此,Capecchi与美国科学家Smithies、英国科学家Evans共同分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖,成为基因敲除研究史上的又一里程碑.经过20多年的不断发展,基因敲除技术(gene knock-out)已经广泛应用于生物医学的各个研究领域,尤其在结核病研究中取得了很大进展,基因敲除技术已成为研究结核病发生、发展机制的重要技术手段.笔者综述了基因敲除技术的原理及其在结核病研究中的应用.
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带有标记基因自删除系统的穿梭载体的构建与功能鉴定
构建一个具有标记基因自动删除功能的穿梭质粒载体pZL-EGFP,用于快速准确地筛选符合临床试验要求的携带有外源目标基因的重组痘苗病毒MVA(rMVA).为构建pZL-EGFP,将原有穿梭质粒pSC11的标记基因由LacZ置换成EGFP基因,并在EGFP基因的两侧插入TKL的同源序列.pZL-EGFP与MVA病毒共转染BHK-21细胞后经10代传代,一次噬斑筛选以获得携带有外源基因且EGFP已被删除的rMVA.终获得的rM-VA通过PCR和Western Blot方法对pZL-EGFP的功能进行鉴定.成功构建出具有标记基因自动删除功能的穿梭质粒载体pZL-EGFP,包装获得的重组痘苗病毒可在传代过程中自动删除标记基因EGFP.基因删除未影响重组病毒的活力,外源蛋白的表达具有良好的稳定性.pZL-EGFP能与MVA病毒在BHK-21细胞内发生同源重组并包装出rMVA,其携带的标记基因可在病毒传代过程中通过分子内同源重组被自动删除,基因删除不影响重组病毒的活力及外源基因的表达,这为进一步的研究奠定了坚实的基础.
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携带GFP绿色荧光标记的重组BAC-HSV-1HF株的构建及其子代病毒的特性研究
本研究旨在构建由细菌人工染色体(Bacteria artificial chromosome,BAC)携带的单纯疱疹I型病毒质粒及携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的重组型BAC-HSV-1感染性子代病毒.构建了携带HSV-1同源臂的质粒C223-UL43左臂-UL47右臂.将该质粒线性化后与HSV-1基因组共转染至Vero细胞,通过真核细胞内同源重组产生了含有GFP报告基因的BAC-HSV-1重组病毒,噬斑纯化筛选出阳性重组病毒,并再次感染Vero细胞,Hirt法提取BAC-HSV-1环形基因组并将其电穿孔入DH10B感受态细胞,由PCR和酶切法鉴定BAC-HSV-1质粒.为研究BAC-HSV-1子代病毒的生物学特性,将实验组和对照组细胞分别给予BAC-HSV-1质粒和HSV-1基因组DNA,收取病变细胞的上清液,以MOI=0.1再次感染Vero细胞,半数组织培养感染剂量(50%tis-sue culture infective dose,TCID50)法测定两组的病毒滴度.PCR和酶切法分别鉴定BAC-HSV-1,结果示BAC-HSV-1构建成功.TCID50法测定实验组和对照组病毒滴度,经统计学分析两组病毒滴度间差异无统计学意义(P＞0.05).本研究成功地构建了真核细胞和原核细胞间穿梭的HSV-1-BAC重组病毒/质粒.
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表达猪瘟病毒石门株E2抗原的重组腺病毒构建及免疫性研究
应用PCR从pMD18-T-E2质粒中扩增编码猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带CSFV E2基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E2,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E2,PCR证实E2基因已整合至腺病毒基因组中,Western blot结果检测到重组病毒转染293细胞中E2蛋白的表达.ELISA检测结果表明,pAd-E2能刺激小鼠产生高效价的抗体,也能刺激猪体产生抗体.将pAd-E2通过肌肉和皮下接种途径免疫商品化猪2次,21d后用1 000倍TCID50 CSFV强毒攻击.pAd-E2免疫组有1/4头死亡,而非重组腺病毒pAd-CMV免疫组和空白对照组全部死亡.该研究为研制猪瘟基因工程疫苗提供了有用的数据.
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大熊猫犬瘟热病毒H基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定
本研究参照GenBank上已公布的大熊猫犬瘟热病毒(CDV)H编码的基因序列,对其抗原保守结构和识别区域进行修饰,将CDV保护性抗原H基因克隆到pMDTK-pEL载体中,然后运用酶切、连接将表达盒PELH构建到pTK-Eg载体中,从而获得重组转移载体质粒pTK-H-Eg.将重组转移载体质粒pTK-H-Eg与GTPV AV41株共转染BHK细胞,使其在细胞内发生同源重组,获得重组CDV的H基因的山羊痘病毒,然后在Vero细胞上加压筛选,利用gpt培养基筛选到稳定表达EGFP的重组病毒.通过PCR、免疫荧光以及Western Blot鉴定,证明CDV H基因成功构建到GTPV基因组中,并且在细胞中获得了正确表达.本研究获得了表达CDV H基因重组山羊痘病毒,并命名为vpTK-H-Eg.
关键词： 犬瘟热病毒(CDV) 同源重组 重组山羊痘病毒 -
重组人KNDC1腺病毒表达载体的构建及其促HUVEC衰老作用
目的 构建人KNDC1腺病毒表达载体,观察其在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的表达及功能.方法 扩增KNDC1基因并与腺病毒骨架载体进行体外重组连接,经筛选、测序确认后转染进HEK293A细胞进行包装;按pAd-enoX试剂盒的步骤纯化重组腺病毒,通过终点稀释法测定病毒滴度;用pAdeno X-KNDC1感染HUVEC,48 h后用Western blot检测KNDC1蛋白表达水平;用SA-β-gal染色检测细胞衰老情况.结果 经测序确认目的基因KNDC1成功克隆入腺病毒载体中.转染HEK293A细胞后观察到细胞变圆、部分细胞漂浮的特征性病变效应,病毒滴度达到1×1011 PFU.感染了pAdeno X-KNDC1的HUVEC中KNDC1蛋白表达水平显著升高(P＜0.05).随着pAdenoX-KNDC1剂量的增加,衰老HUVEC数量增多.结论 人KNDC1腺病毒表达载体构建成功并能促进HUVEC衰老.
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征服癌症的双刃刀--Rad51 D蛋白
人类Rad51蛋白是同源重组的关键酶,发挥着链转移或链交换活性,启动DNA同源配对的作用.Rad51D蛋白是Rad51蛋白的5种同源物之一,对细胞调节有正反两种作用机制:一方面作为辅助因子参与DNA修复同源重组,维持正常细胞周期;另一方面又是诱发癌症病变,防止癌细胞衰老的因素之一.Rad51D蛋白对细胞的作用机制,是人类征服癌症的双刃刀,如果阻止癌细胞的Rad51D蛋白作用可以促进癌细胞的死亡;而同时Rad51D蛋白作用的减弱将使细胞发生周期紊乱,产生新的病变.本文将近年来有关Rad51D的研究成果进行了整理,主要包括Rad51D蛋白的生物学特征和生物学功能两部分,同时对Rad51D蛋白的研究方向提出了自己的看法.
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重组人肝细胞生长因子-NK4腺病毒的制备及初步鉴定
目的 制备表达人肝细胞生长因子(HGF)-NK4蛋白的复制缺陷型重组腺病毒.方法 酶切pcDNA3-hNK4质粒获得NK4基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrack-CMV-NK4载体,线性化后与pAdEasy-1共转化BJ5183,通过同源重组得到重组pAd-NK4病毒载体.将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,用病毒悬液感染人肝癌细胞株HepG2.RT-PCR法检测感染肿瘤细胞中NK4 mRNA表达.结果 酶切鉴定得到阳性pAd-NK4重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装.在转染2d后能观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达.制备的Ad- NK4在体外能有效感染HepG2细胞并获得NK4基因高水平表达.结论 成功构建了NK4基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒,为进一步研究NK4基因的功能及应用NK4进行基因治疗提供实验依据.
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两步法细菌内同源重组制备重组单核细胞趋化因子-1腺病毒
目的 两步法提高细菌内同源重组效率制备重组人单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)复制缺陷型腺病毒.方法 制备含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183,Hind Ⅲ酶切筛选未发生细菌内重组的菌落,并将其制备成感受态(BJ5183pAdEasy-1).RT-PCR法克隆得到MCP-1 cDNA片段,连接到pMD18-T载体后亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack上构建重组穿梭载体pAdTrack-MCP-1.PmeⅠ酶切线性化并碱性磷酸酶处理pAdTrack-MCP-1,然后电穿孔转化感受态BJ5183pAdEasy-1.PacⅠ酶切筛选得到正确重组的腺病毒载体pAd-MCP-1,将pAd-MCP-1转染入HEK293细胞中包装病毒颗粒,以PCR法鉴定.结果 成功构建pAd-MCP-1,效率可达50%以上,pAd-MCP-1能有效转染HEK293细胞并在细胞内包装.PCR鉴定病毒携带有MCP-1基因片段.结论 两步法细菌内同源重组构建重组腺病毒载体较常规电穿孔共转化效率高.成功制备重组腺病毒颗粒为进一步研究MCP-1的作用提供了重要的方法.
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基因敲除质粒载体的构建及其在幽门螺杆菌基因敲除中的应用
目的 构建用于幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)同源重组双交换基因敲除的质粒载体,实现Hp内基因的快速敲除. 方法 以质粒pLYL03为骨架,重新排列质粒上的基因元件以减少冗余序列,用卡那霉素抗性基因(aphA)替换原质粒上的红霉素抗性基因作为抗性筛选标记,在抗性筛选标记两端构建多克隆位点用于同源重组同源臂的插入,由此构建用于Hp同源重组双交换基因敲除的质粒载体pSJHK.以质粒pSJHK为载体构建hp0169基因的同源重组双交换敲除质粒pSJHK-0169,通过电击转化方法将敲除质粒pSJHK-0169转入Hp中,用卡那霉素筛选转化子.结果 以质粒pLYL03为基础构建用于Hp同源重组双交换基因敲除的质粒载体pSJHK,大小4 371 bp.以基因hp0169作为目标基因构建同源重组双交换敲除质粒pSJHK-0169,经电击转化Hp中,获得卡那霉素抗性阳性转化子,测序确证基因敲除成功. 结论 构建的基因敲除质粒载体pSJHK实现了对Hp中目标基因的敲除,为Hp新基因功能研究和致病因子的发掘提供了有效的基因操作工具.
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双酶切和同源重组方法构建pMIR-reporter载体的比较
目的 以pMIR reporter为载体骨架,通过双酶切方法和同源重组方法构建载体,比较两种不同载体构建方法的优缺点.方法 双酶切方法使用HindⅢ和MluⅠ两种限制性内切酶分别酶切pMIR-reporter和经T A克隆后靶基因PCR片段,形成带有相同粘性末端的线性载体片段和PCR片段,然后利用T4 DNA连接酶连接,连接产物转化大肠埃希菌感受态细胞,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平扳进行阳性单克隆筛选并测序.同源重组方法利用同源重组原理,通过重组酶将靶基因PCR片段和经HindⅢ酶切pMIR-reporter线性载体重组连接,连接产物转化入大肠埃希菌感受态细胞中,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平饭进行阳性克隆筛选并测序.结果 从载体构建耗时、总步骤数和阳性率三方面进行比较,双酶切载体构建方法需要26个独立试验,试验净耗时96h,阳性率为95％;同源重组法需要14个独立试验,试验净耗时33h,阳性率为70％.结论 双酶切载体构建方法步骤繁琐.同源重组法步骤相对简单,可以高效快速地构建载体,但是假阳性率略高.
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缺失TC7L-TK2L基因减毒天坛株痘苗病毒构建及筛选
目的 通过敲除天坛株痘苗病毒(Vaccinia virus Tiantan strain,VTT)的复制非必需基因TC7L-TK2L,并结合双标记筛选及外源筛选标记敲除技术构建TC7L-TK2L基因缺失的VTT弱毒株rVTT-TC7L--TK2L-. 方法 人工合成含有痘病毒早晚期复合强启动子pE/L和外源筛选标记增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的重组臂,构建穿梭质粒pTC7L-TK2L-EGFP,再与VTT共转染BHK-21细胞,通过连续筛选10次,获得含有筛选标记的重组痘苗病毒rVTT-TC7L-TK2L--EGFP+;利用Cre/loxp系统敲除EGFP,连续筛选10次,获得无筛选标记的重组痘苗病毒rVTT-TC7L--TK2L-,用PCR方法对rVTT-TC7L--TK2L-进行鉴定和遗传稳定性检测,用电镜观察病毒形态变化,并通过绘制生长曲线观察病毒在细胞内的复制情况. 结果 PCR结果表明,成功构建了重组痘苗病毒rVTT-TC7L-TK2L-,且具有良好的遗传稳定性;电镜观察痘苗病毒缺失TC7L-TK2L基因未影响病毒形态;生长曲线显示敲除TC7L-TK2L基因后病毒毒力显著下降,但不影响病毒的正常复制. 结论 成功构建了痘苗病毒减毒株rVTT-TC7L--TK2L-,该重组痘苗具有良好的遗传稳定性且毒力减弱.
关键词： 重组天坛株痘苗病毒 病毒载体 同源重组 TC7L-TK2L基因 -
耶尔森菌中IS100研究概况
IS100是特异性地出现在鼠疫菌和假结核耶尔森菌中的插入序列,它在鼠疫耶尔森菌的染色体中有多个拷贝,在质粒中也有分布.它的转座活性较高,致使鼠疫菌中出现多个假基因,同向IS100之间的同源重组可以导致鼠疫菌发生基因的水平转移.
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基因打靶技术在构建人源体细胞基因敲除或敲入细胞系中的应用
基因打靶技术能够帮助人们认识某些动物个体或细胞表型异常的遗传基础,利用该技术构建的模式生物(例如基因敲除小鼠)已经广泛地应用于人类基因的研究[1],截至1999年就已经报道了800多个模式小鼠种系.同源重组介导的基因打靶技术(基因敲除或敲入)是判定基因功能的强有力工具.与基因敲除小鼠相比,人类体细胞基因敲除或敲入细胞系构建的报道相对较少,但该项技术在细胞水平上对某些人源基因参与的生化或生理途径的分析是不可替代的.
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新城疫病毒HN糖蛋白头颈部相互作用区基因突变分析
目的 明确新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)包膜糖蛋白血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)头颈部相互作用区91～112氨基酸(aa)片段的功能,阐明该区域促进细胞特异性膜融合的作用.方法 比对NDV HN 91～112 aa与MeV H、RSV G、hPIV3 HN,确定吸附蛋白相应的基因序列,采用片段缺失、置换和同源重组技术,构建NDV HN缺失突变体De(HN)和嵌合体Ch(MeV)、Ch(RSV)、Ch(hPIV3);痘苗病毒-T7瞬时表达系统在真核细胞BHK-21内表达各突变体;间接免疫荧光法和流式细胞术分析各突变体蛋白在细胞表面的表达情况;蛋白功能试验分别测定各突变体蛋白的促细胞融合活性、受体识别活性和神经氨酸酶活性.结果 De(HN)和Ch(MeV)、Ch(RSV)、Ch(hPIV3)的细胞表面表达效率分别为野生型的9.04％、82.20％、70.16％和75.65％;促细胞融合活性分别为野生型的3.83％、24.76％、29.42％和57.84％(P均＜0.05),其中De(HN)的促细胞融合活性基本消失,镜下未观察到合胞体形成;受体识别活性分别为野生型的13.48％、36.25％、34.93％和65.22％(P均＜0.05),与促细胞融合活性具有一致性;神经氨酸酶活性分别为野生型的10.81％、54.42％、50.13％和60.35％(P均＜0.05).结论 NDV HN蛋白91-112aa对膜融合功能有重要影响,缺失突变体膜融合功能的消失与其未能在细胞表面有效表达有关.
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同源重组构建表皮葡萄球菌附属基因调节子(agr)阴性突变株
目的构建表皮葡萄球菌agr阴性突变株,以期得到除agr基因以外相同遗传背景的突变株与野生株. 方法首先构建同源重组质粒pBT2-△agr,后电转入金黄色葡萄球菌RN4220,再转入表皮葡萄球菌3298.通过pBT2载体对温度敏感的特点,含重组质粒的表皮葡萄球菌3298在40℃多次传代,终筛选出agr阴性的突变株. 结果同源重组质粒pBT2-△agr通过酶切鉴定证明构建成功,表皮葡萄球菌3298接受来自金黄色葡萄球菌RN4220的重组质粒,经酶切鉴定正确.40℃多次传代后,经抗生素抗性筛选,并经斑点杂交及序列分析,证明获得表皮葡萄球菌3298-agr阴性突变株. 结论用同源重组的方法完成表皮葡萄球菌3298-agr阴性突变株的构建,使agr基因被大部分剔除掉.为今后研究表皮葡萄球菌agr基因在调节其生物膜形成的功能提供实验资料.
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耐甲氧西林表皮葡萄球菌 psm-mec 缺失突变株的构建
目的：构建耐甲氧西林表皮葡萄球菌（ MRSE）的psm-mec缺失突变株，并对psm-mec的功能进行初步研究。方法运用药敏试验、DNA序列分析技术筛选psm-mec上下游序列与S．epi-dermidis标准菌株RP62A完全一致且四环素和氯霉素敏感的MRSE。利用融合PCR和温度敏感性穿梭质粒构建同源重组质粒pBT2-Δpsm-mec，经鉴定后电转金黄色葡萄球菌RN4220进行修饰，提取质粒后电转用于构建缺失突变的临床分离MRSE，经同源重组后筛选和鉴定psm-mec缺失突变株。分析缺失突变株与野生株生物被膜形成能力的差异，验证psm-mec与MRSE生物被膜的关系。结果通过序列比对和药敏试验筛选和鉴定了3株用于构建psm-mec缺失突变的临床分离MRSE。通过同源重组，筛选和鉴定获得psm-mec缺失突变株。与相应的野生株比较，3株缺失突变株生物被膜形成能力明显降低，提示psm-mec可诱导MRSE生物被膜形成。结论成功获得耐甲氧西林表皮葡萄球菌psm-mec缺失突变株，psm-mec与表皮葡萄球菌生物被膜形成相关。
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变异链球菌luxS基因缺陷突变株生物学性状的初步观察
目的 为研究口腔主要致龋菌变异链球菌的种属间密度感应(quorum sensing)相关基因luxS对口腔生态的影响,构建此菌的luxS基因缺失突变株.方法 采用同源重组的方法,利用红霉素耐药基因erm置换变异链球菌基因组中的luxS基因,并在含抗性标记的选择性培养基上筛选出阳性克隆.初步研究该基因的缺失突变对变异链球菌在生长与生物被膜成熟分化中的作用.结果经PCR鉴定,luxS基因的置换突变位置正确,并能在体外稳定传代,突变株与野生株相比在达静止期后总菌数量上有明显差别,但在生物被膜的形成与分化上并未发现显著差异.结论 通过此研究建立了可稳定传代的变异链球菌luxS基因的缺失突变株,生长表型和生物被膜的形成与野生株无显著差异,为进一步研究此基因功能与调控机制提供了技术平台.
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表皮葡萄球菌生物被膜形成相关icaC敲除突变株的构建及其表型的改变
目的 构建表皮葡萄球菌icaC阴性突变株,以期获得仅icaC基因不同而其他遗传背景与表皮葡萄球菌1457株相同的突变株,对icaC基因产物在细菌形成生物被膜中的作用进行研究.方法 构建同源重组质粒pBT2-△icaC,经金黄色葡萄球菌RN4220株修饰后电转化入表皮葡萄球菌1457株.将含重组质粒的表皮葡萄球菌1457株在40℃多次传代,筛选出icaC敲除突变株(△icaC株).检测△icaC株生长曲线,采用微量板半定量法检测细菌生物被膜的形成能力,并采用斑点免疫印迹法检测细菌多糖黏附因子的合成.结果 使用同源重组法敲除表皮葡萄球菌1457株基因组中的icaC基因,△icaC株的生长曲线与表皮葡萄球菌1457株相似,但生物被膜形成能力及细胞外多糖黏附因子含量显著降低.结论 表皮葡萄球菌1457株中icaC基因的缺失对细菌生长无明显影响,但显著降低细胞外多糖黏附因子含量及生物被膜形成能力,为进一步研究表皮葡萄球菌icaC基因在生物被膜形成中的作用奠定基础.
