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Ra1362调控环二鸟苷酸影响结核分枝杆菌H37Ra的生物膜发育和休眠
目的 通过敲除环二鸟苷酸(c-di-GMP)合成酶基因Ra1362探讨该基因在结核分枝杆菌(MTB)H37Ra株生物膜发育和休眠中的作用.方法 以MTB H37Ra株为出发菌株,敲除合成酶基因Ra1362获得基因敲除株△Ra1362,通过体外实验比较细菌的生物膜形成变化;应用转录谱基因芯片和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测野生株和敲除株基因表达的情况变化;同时构建体外快速厌氧休眠模型比较细菌克隆形成、休眠相关基因的表达和活细胞染色情况.结果 △Ra1362株于痰液管中培养26 d时已形成较厚的皱褶生物膜,形成生物膜的速度明显快于野生株5d;转录谱基因芯片和定量RT-PCR结果也显示△Ra1362株中19个与休眠相关基因的表达水平下调并能通过基因回补和外源添加c-di-GMP所补偿;在快速厌氧模型中发现,迟缓期过后△Ra1362株对氧气的消耗比野生株组要快12h,且细菌处于不能恢复正常生长的休眠状态.结论 Ra1362基因通过控制c-dLGMP的合成调控MTB感应缺氧或者氧化还原压力,一方面调控生物膜的发育,另一方面在缺氧条件下通过调控DosR调节子基因的表达来调节细菌的休眠.
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基因敲除技术在结核病研究中的应用
1989年,美国科学家Capecchi通过研究胚胎干细胞同源重组原理获得的基因敲除小鼠取得成功,因此,Capecchi与美国科学家Smithies、英国科学家Evans共同分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖,成为基因敲除研究史上的又一里程碑.经过20多年的不断发展,基因敲除技术(gene knock-out)已经广泛应用于生物医学的各个研究领域,尤其在结核病研究中取得了很大进展,基因敲除技术已成为研究结核病发生、发展机制的重要技术手段.笔者综述了基因敲除技术的原理及其在结核病研究中的应用.
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副溶血弧菌生物膜相关基因突变株的构建
目的 构建副溶血弧菌生物膜相关基因突变株并进行验证.方法 采用PCR方法扩增得到靶基因的上下游同源臂片段,然后以上下游同源臂片段为模板,PCR扩增得到同源臂融合片段.将同源臂融合片段经酶切处理后克隆到自杀质粒pDS132中.通过结合转移的方式将携带有同源臂融合片段的重组质粒转入副溶血弧菌RIMD 2210633中,利用同源重组得到突变株.用PCR方法筛选和鉴定突变株,同时对突变株进行表型分析,从而在分子水平和表型试验上验证突变株是否构建成功.结果 构建得到了分别携带副溶血弧菌生物膜相关基因vbfR、crp、hns、swrZ、swrT、cpsR融合同源臂片段的重组质粒,通过PCR扩增,分别得到了大小为1190、1128、1136、953、1242、1112 bp的片段；用重组质粒构建了相应的突变株(ΔvbfR、Δcrp、△hns、ΔswrZ、ΔswrT和ΔcpsR),进行PCR鉴定时,突变株得到了大小分别为1190、1128、1136、953、1242、1112 bp的扩增产物,比阳性对照分别小610、739、421、542、427、1367 bp;用靶基因内部的引物进行扩增时,无扩增产物；选其中一株突变株Δhns进行生物膜形成能力表型分析,结果表明突变株Δhns生物膜形成量与野生株相比明显增加.结论 构建得到了6株副溶血弧菌生物膜相关基因突变株,并从分子和表型试验上验证了突变株构建正确.
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TNF-α-shRNA对结核菌素诱导破骨细胞形成的影响
目的:构建靶向肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)基因的短发卡RNA (short hairpin RNA,shRNA)表达载体,观察其对结核菌素(purified protein derivative,PPD)诱导破骨细胞形成的影响.方法:双酶切法构建TNF-α-shRNA,经脂质体转染小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞),通过荧光显微镜观察TNF-α-shRNA的转染情况;采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)观察转染前及转染后第1、3、5、7天TNF-α基因的表达情况;以RAW264.7细胞为空白组、RAW264.7细胞+1IU· ml-1PPD为对照组、RAW264.7细胞+TNF-α-shRNA+1 IU· ml-1pPD为转染观察组、RAW264.7细胞+空载质粒+1 IU· ml-TPD为阴性转染组,采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)检测各组第3天TNF-α基因和蛋白的相对表达量;采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)计数各组第7天破骨细胞形成的数量.结果:TNF-α-shRNA经脂质体成功转染RAW264.7细胞,转染效率达70％～80％.RT-PCR显示转染后第3天TNF-α基因的表达少,第5天次之,第1天、第7天和转染前比较差异不大.转染后第3天转染观察组TNF-α基因的相对表达量为0.46±0.03,同时间点空白组为1.00±0.00,对照组为1.43±0.09,阴性转染组为1.38±0.06.转染后第3天转染观察组TNF-α蛋白的相对表达量为55.34±0.82,同时间点空白组为59.13±1.43,对照组为82.72±1.84,阴性转染组为84.62±0.97.转染后第7天转染观察组破骨细胞形成的数量为19.33±1.53个,同时间点空白组为5.67±1.53个,对照组为56.67±3.79个,阴性转染组为59.67±3.51个.转染观察组的TNF-α基因和蛋白的相对表达量及破骨细胞数量与空白组、对照组、阴性转染组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);空白组与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);对照组与阴性转染组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:TNF-α-shRNA可以特异性地沉默RAW264.7细胞内TNF-α基因的表达,使TNF-α的产生减少,抑制PPD诱导的破骨细胞形成.
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CNOT7基因参与诱导HepG2细胞对Vγ9Vδ2T细胞的免疫耐受
目的 研究人CCR4-NOT转录复合体亚基7(CCR4-NOT transcription complex subunit 7 human,CNOT 7)在HepG2肝母细胞癌系(hepatoblastoma G2 cell line,HepG2 cells)对Vγ 9V82T淋巴细胞免疫耐受中的作用及相关机制.方法 用CNOT 7重组质粒(recombinant plasmid of CNOT,shCNOT7)及相应对照组载体质粒转染HepG2细胞,用Vγ 9V82T细胞因子干预转染前后的各组细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,Western blot方法检测CNOT7及信号传导及转录激活因子1(signaltransducer and activator of transcription 1,STAT1)、STAT3的蛋白表达水平.Western blot法检测HepG2肝癌细胞系及人正常肝细胞系L02中CNOT7、STAT1和STAT3蛋白的表达水平. 结果 Vγ9Vδ2T细胞因子干预后,CNOT 7基因敲减后的HepG2细胞组凋亡率由(7.55％±2.63％)增加至(20.59％±3.12％).与L02细胞组比较,HepG2细胞组中的CNOT7蛋白高表达(F=28.76,P＜0.01),STAT3蛋白高表达(F=110.29,P＜0.01),STAT1蛋白低表达(F=35.67,P＜0.01).CNOT7基因敲除后,HepG2细胞组的STAT1蛋白表达上调(=6.69,P＜0.05). 结论 CNOT7基因参与诱导HepG2细胞Vγ9Vδ2T细胞的免疫耐受,敲减CNOT7基因可逆转HepG2细胞对Vγ 9Vδ2T细胞的免疫耐受.
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高脂饮食结合球囊损伤快速建立ApoE-/-大鼠动脉粥样硬化模型
目的 探索利用短期高脂饮食结合球囊损伤的造模方式,快速建立载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)大鼠动脉粥样硬化(AS)动物模型.方法 选择8周雄性SD大鼠(n=10)及ApoE-/-大鼠(n=10),高脂饮食2周后分别检测两组血常规、肝肾功能、血脂谱及C反应蛋白(CRP)等指标.随后行大鼠左侧颈总动脉球囊损伤术,2周后采用过量水合氯醛处死大鼠,取术侧颈总动脉进行HE、Masson及油红O染色,并行CD68、α平滑肌蛋白(α-SMA)免疫荧光染色.结果 ApoE-/-大鼠血脂水平明显高于SD大鼠[总胆固醇(TC):18.56±2.82mmol/L vs 5.69±1.98mmol/L,P＜0.01;低密度脂蛋白(LDL):6.86±1.47mmol/L vs 1.92±0.76mmol/L,P＜0.01];与SD大鼠比较,在严重血脂紊乱状态下,ApoE1-/-大鼠全身处于显著炎症状态[CRP:4.66±0.57mg/L vs 0.39±0.21mg/L,P＜0.05;白细胞:(21.79土5.10)×109/L vs(14.82±2.41)×109/L,P＜0.01;中性粒细胞:(9.28±3.35)×109/L vs(2.10±0.96)×109/L,P＜0.01].HE及Masson染色结果显示,两组均有显著增生形成,并伴随着胶原纤维的轻度沉积;油红O染色可见ApoE-/-大鼠斑块增生明显,而SD大鼠呈阴性.免疫荧光染色结果显示,ApoE-/-大鼠斑块内CD68呈显著阳性,α-SMA呈弱阳性,而SD大鼠α-SMA呈阳性,无明显CD68显色.结论 通过短期高脂饮食结合球囊损伤的造模方式,可以快速建立ApoE-/-大鼠AS模型.
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RNA腺苷脱氨酶在MLL-AF9诱导的小鼠急性髓系白血病发病中的作用
目的 建立敲除RNA腺苷脱氨酶1(ADAR1)的小鼠MLL-AF9融合基因急性髓系白血病(AML)模型,初步探讨ADAR1对AML发病的影响.方法 采用免疫磁珠法富集介导雌激素受体-重组酶Cre(ER-Cre)的ADAR1lox/lox及其对照ADAR1lox/lox小鼠骨髓Lineage-(Lin-)细胞,用携带MSCV-MLL/AF9-IRES-GFP的逆转录病毒感染上述Lin-细胞,流式细胞术检测感染效率,移植相同数量细胞至致死剂量和半致死剂量照射受体小鼠中,建立MLL-AF9诱导的AML模型.移植48 h后诱导ADAR1敲除,体内实验分为实验组(ER-Cre;ADAR1lox/lox+他莫昔芬)和对照组(①ER-Cre;ADAR1lox/lox+空载体、②ADAR1lox/lox+他莫昔芬、③ADAR1lox/lox+空载体),第10、15、20天分别检测小鼠外周血GFP+细胞比例,观察各组小鼠的存活情况.体外实验分组同上,将他莫昔芬改为4-羟基他莫昔芬,观察各组AML细胞并检测其凋亡情况.结果 成功建立敲除ADAR1的MLL-AF9融合基因AML小鼠模型.与对照组比较,体内实验中实验组AML小鼠在各时间点外周血GFP+细胞比例均降低,存活时间明显延长,差异均有统计学意义(P值均＜0.05);体外实验中实验组细胞总数、GFP+细胞比例均降低,Annexin Ⅴ+7-AAD+和Annexin Ⅴ+细胞比例均升高,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论 敲除ADAR1可减缓AML的发病,增加AML细胞凋亡.ADAR1在MLL-AF9诱导的AML发生和维持过程中起关键作用.
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转化生长因子β1及成纤维细胞生长因子基因敲除对尘肺小鼠肺纤维化的影响
目的 探讨转化生长因子β1(TGF-ββ1)、成纤维细胞生长因子(FGF)基因敲除对尘肺小鼠肺纤维化的影响.方法 将160只雄性BALB/c白色纯合子小鼠随机分为空白对照组、尘肺模型组、TGF-β1及FGF基因敲除组,每组40只.TGF-ββ1及FGF基因敲除组分别敲除TGF-β1及FGF基因.除空白对照组气道内灌入生理盐水外,其他3组于气道内灌入煤粉尘生理盐水混悬液,继续饲养,第16周测定TGF-β1、FGF水平并取肺组织行HE染色观察,分析血清及肺组织匀浆TGF-β1与FGF水平的相关性.结果 与空白对照组比较,尘肺模型组、TGF-β1及FGF基因敲除组第16周肺系数、血清及肺组织匀浆TGF-ββ1、FGF水平增高(P＜0.05);与尘肺模型组比较,TGF-β1及FGF基因敲除组第16周上述指标均降低(P＜0.05).尘肺模型组血清及肺组织匀浆TGF-β1与FGF呈正相关(r=0.420、0.512,P ＜0.05).结论 TGF-β1及FGF参与尘肺小鼠肺纤维化过程,TGF-β1及FGF基因敲除能抑制肺纤维化.
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α7烟碱型乙酰胆碱受体基因敲除对非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝脏炎症的影响研究
目的：探讨α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）基因敲除对非酒精性脂肪性肝炎（ NASH）小鼠肝脏炎症的影响。方法2014年6月—2015年5月，选取40只 SPF 级雄性6周龄 C57BL/6J 小鼠和40只 SPF 级雄性6周龄α7nAChR基因敲除小鼠，采用随机数字表法分为 C57普通饲料组、C57高脂高糖组、基因敲除普通饲料组、基因敲除高脂高糖组，每组20只。C57普通饲料组、基因敲除普通饲料组小鼠给予普通饲料喂养，C57高脂高糖组、基因敲除高脂高糖组小鼠给予高脂饲料喂养同时饮用20%果糖饮用水，喂养24周，建立 NASH 小鼠模型；小鼠饲养期间定期称量体质量，并且尾静脉取血检测丙氨酸氨基转移酶（ ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（ AST）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）水平。21周时 C57高脂高糖组、基因敲除高脂高糖组小鼠给予400μg/ kg 烟碱腹腔注射；C57普通饲料组、基因敲除普通饲料组小鼠给予等量0.9%氯化钠溶液腹腔注射，均1次/ d，共3周。24周后处死小鼠，眼球取血，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清炎性细胞因子白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平，观察小鼠肝脏外观变化及肝脏湿重，肝脏病理切片染色观察炎症程度和脂肪变性情况。结果第12、15、18、21、24周时，C57高脂高糖组、基因敲除高脂高糖组小鼠体质量较 C57普通饲料组、基因敲除普通饲料组升高（P <0.05）；第12、15、18、21、24周时，基因敲除高脂高糖组小鼠体质量较 C57高脂高糖组升高（P <0.05）。C57高脂高糖组、基因敲除高脂高糖组小鼠第8、16、24周时血清 ALT、AST、TG、TC 水平，第24周时血清 IL-6、TNF-α水平、肝脏湿重较 C57普通饲料组、基因敲除普通饲料组升高（P <0.05）；基因敲除高脂高糖组小鼠第8、16、24周时血清 ALT、AST 水平，第16、24周时血清 TG、TC 水平，第24周时血清 IL-6、TNF-α水平、肝脏湿重较 C57高脂高糖组升高（P <0.05）。病理切片苏木素-伊红（HE）、油红染色结果显示：C57普通饲料组、基因敲除普通饲料组小鼠炎症程度和脂肪变性均不明显，C57高脂高糖组、基因敲除高脂高糖组小鼠在第8 周开始出现轻微炎症和脂肪变性，以小脂滴为主，到第16、24周，炎症和脂肪变性逐渐加重，脂肪变性以中、大滴为主，基因敲除高脂高糖组小鼠肝脏组织炎症程度和脂肪变性均明显重于 C57高脂高糖组小鼠。结论α7nAChR基因敲除能够明显加重 NASH 小鼠的肝脏炎症。
关键词： 非酒精性脂肪性肝炎 基因敲除技术 α7 烟碱型乙酰胆碱受体 细胞因子类 炎症 -
一种用于白念珠菌基因敲除的新型载体的构建
目的 探讨对抗生素Zeocin耐药作为一种新的筛选标记用于白念珠菌基因敲除的可行性.方法药物敏感试验检测在不同pH值下Zeocin对白念珠菌的低抑菌浓度(MIC).PCR法扩增出Zeocin耐药基因--ZeoR,基因拼接方法构建出用于AAF1基因敲除的整合型载体pHS1-Zeo-HS2,并进行测序鉴定.氯化锂法将此整合型载体转化白念珠菌CAI4,对目的基因AAF1进行替换.Zeocin筛选出重组白念珠菌,提取重组菌基因组,用两组引物进行PCR扩增,进行遗传学鉴定.结果不同pH值下白念珠菌对Zeocin均敏感,并确定100 mg/L为筛选浓度.测序鉴定成功拼接出用于白念珠菌基因敲除的整合型载体.耐Zeocin重组白念珠菌使用PCR方法和测序鉴定,发现原AAF1基因已被ZeoR基因替代.结论成功构建可用于白念珠菌基因敲除的新型载体.
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基于CRISPR/Cas9技术的SRSF9基因敲除对成胶质细胞瘤生物学功能的影响
目的:基于成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats,CRISPR) /Cas9系统构建富含丝氨酸/精氨酸剪切因子9(serine-arginine-rich splicing factor 9,SRSF9)基因敲除的人脑胶质瘤U87稳定细胞株,研究SRSF9在人成胶质细胞瘤中的生物学功能.方法:利用CRISPR/Cas9系统构建3个针对SRSF9基因的单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA),将其转入胶质瘤U87细胞后,采用蛋白质印迹法鉴定SRSF9基因敲除效率.采用有限稀释法挑选出3株SRSF9基因敲除的U87单克隆细胞株并扩增,采用CCK-8法和EdU掺入的FCM法检测细胞体外增殖能力,采用平板克隆形成实验和干细胞成球实验分别检测细胞体外克隆形成和成球的能力,采用裸鼠皮下成瘤实验检测细胞体内成瘤的能力.结果:3条sgRNA成功插入慢病毒载体中,且序列正确.经慢病毒感染效率分析及蛋白质印迹法鉴定证明,SRSF9基因敲除的U87多克隆细胞株构建成功;经蛋白质印迹法和DNA测序确认SRSF9基因敲除的U87单克隆细胞株构建成功,序列发生移码突变.SRSF9基因敲除后,U87单克隆细胞的增殖和克隆形成能力均明显降低(P值均＜0.05),肿瘤干细胞成球能力也明显下降(P＜0.001),而且在裸鼠体内的成瘤能力明显减弱(P＜0.01).结论:成功建立基于CRISPR/Cas9技术的SRSF9基因敲除的脑胶质瘤U87细胞株,并通过功能实验证明SRSF9是成胶质细胞瘤的一个关键致癌基因.
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细胞周期蛋白依赖性激酶7基因沉默或敲除抑制卵巢癌细胞增殖及其机制探讨
目的:探讨细胞周期蛋白依赖性激酶7 (cyclin-dependent kinase 7,CDK7)对卵巢癌细胞增殖的作用.方法:应用特异性siRNA转染法沉默卵巢癌OVCA433、TOV-112D和IGROV1细胞中CDK7基因表达后,采用CCK-8法检测细胞增殖能力.应用成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)及其相关核酸内切酶9(CRISPR-associated endonuclease 9,Cas9)基因编辑系统敲除卵巢癌HEY、OVCA420、OVCA433和IGROV1细胞中的CDK7基因后,采用克隆形成实验检测细胞克隆形成能力.用CDK7抑制剂THZ1处理卵巢癌TOV-112D、IGROV1、OVCA433、OVCAR8、OV90、SKOV3和COV413B细胞后,采用CCK-8法和克隆形成实验检测TOV-112D、IGROV1、OVCA433、OVCAR8和OV90细胞增殖和克隆形成能力,蛋白质印迹法检测IGROV1、OVCA433、SKOV3和COV413B细胞中CDK7蛋白表达水平和RNA聚合酶Ⅱ磷酸化水平.结果:沉默或敲除CDK7基因后,卵巢癌细胞的增殖和克隆形成能力均明显减弱(P值均＜ 0.05).THZ1处理可抑制卵巢癌细胞的增殖和克隆形成,并下调CDK7蛋白表达和RNA聚合酶Ⅱ磷酸化(P值均＜0.05).结论:CDK7可能通过调控RNA聚合酶Ⅱ磷酸化,促进卵巢癌细胞的增殖.
关键词： 卵巢肿瘤 细胞增殖 基因沉默 基因敲除技术 细胞周期蛋白质依赖性激酶类 -
生长因子受体结合蛋白10与糖尿病
2007年,先后有两个实验室利用基因敲除技术证实生长因子受体结合蛋白10(growth factor receptor-bound protein 10,Grb10)与胰岛素抵抗、2型糖尿病以及个体生长发育有关[1-2].另有对美国高加索人的研究发现,人GrblO(hGrb10)基因的单核苷酸多态性与2型糖尿病的发病风险有关[3-4].Grb10的生物学作用及其与疾病的关系备受瞩目,研究前景广阔.
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基因敲除技术在维生素D受体研究中的应用进展
基因敲除技术是一种新的生物遗传工程技术，在生物和医学领域的应用日趋广泛。维生素 D 通过维生素 D 受体的介导发挥多种生理作用，借助维生素 D 受体的基因敲除技术可更清楚地研究维生素 D 的多种生理功能，为以后的生物研究提供新的方向与方法。该文就基因敲除技术应用于维生素 D 受体后对机体肠道功能、抗肿瘤功能、心血管功能方面影响的研究进展作一综述。
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钙结合蛋白S100A1对卵巢癌细胞A2780增殖和迁移的影响
目的 探讨钙结合蛋白S100A1对卵巢癌细胞A2780增殖和迁移的影响.方法 采用慢病毒包装系统将S100A1 shRNA转染卵巢癌细胞A2780,建立敲降S100A1的稳定表达株并进行鉴定;通过CCK-8实验检测细胞增殖能力;通过Transwell小室实验和划痕愈合实验检测细胞迁移能力.结果 实时定量PCR以及Wes-tern Blot方法检测结果表明,成功建立了敲降S100A1的卵巢癌A2780细胞株;CCK-8实验结果显示,实验组第48、72小时的细胞增殖能力明显低于对照组,差异有显著性(P<0.05);Transwell小室实验结果显示,实验组的穿膜细胞数明显少于对照组,差异有显著性(P<0.05);划痕愈合实验结果显示,实验组的细胞划痕愈合能力明显低于对照组.结论 S100A1可促进卵巢癌细胞A2780的增殖和迁移,S100A1可能与卵巢癌的发生和发展有关.
