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利用CRISPR/Cas9技术敲除LSD1基因显著抑制人慢性髓系白血病K562细胞的增殖与CD235a的表达
目的:探索敲除LSD1基因对人慢性髓系白血病K562细胞产生的影响.方法:利用CRISPR/Cas9技术特异性敲除K562细胞系的LSD1基因;通过流式细胞分选技术获得单细胞后,经过扩增培养、Western blot与测序鉴定,分别获得l株LSD1+/-与LSD1-/-细胞株;MTS方法检测LSD1敲除对K562细胞增殖的影响;流式细胞分析技术检测LSD1对K562细胞表面标记表达的影响.结果:成功构建了K562的LSD1+/-与LSD1-/-细胞株;LSD1的敲除显著抑制了K562的增殖及CD235a的表达.结论:LSD1基因对K562细胞的增殖及CD235a的表达具有关键调控作用.
关键词： CRISPR/Cas9技术 LSD1基因 K562细胞 -
利用CRISPR/Cas9技术构建Nedd4基因敲除BMDM巨噬细胞系
目的 利用CRISPR/Cas9技术构建Nedd4基因敲除骨髓衍生巨噬细胞系(BMDM),为研究Nedd4在巨噬细胞中的作用和机制奠定基础.方法 利用在线软件筛选了评分较高的3个针对Nedd4基因的单向导RNA(sgRNA),然后将合成的sgRNA序列插入到PX330质粒中;将重组质粒转入BMDM细胞,通过有限稀释法获取单克隆,采用Western印迹检测单克隆细胞中NEDD4蛋白水平;通过序列测定确认单克隆细胞的DNA序列.结果 通过Western印迹检测获取1株NEDD4蛋白缺失的BMDM细胞;测序结果表明该细胞系中Nedd4基因发生了16 bp的缺失突变.结论 利用CRISPR/Cas9技术构建的Nedd4敲除BMDM细胞系将成为研究Nedd4在巨噬细胞中的功能和机制的有力工具.
关键词： CRISPR/Cas9技术 Nedd4 基因敲除 巨噬细胞 -
靶向BCOR基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立与基因编辑
目的 构建靶向B细胞淋巴瘤因子6共抑制因子(BCL6 co-repressor,BCOR)基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统,并在HEK 293T细胞系中进行BCOR基因编辑,为研究BCOR的功能打下基础.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计两对靶向BCOR基因的单链引导RNA(small guide RNA,sgRNA),将PX458载体进行BbsⅠ酶切,将sgRNA插入到PX458载体中,转化到宿主菌DH5α大肠埃希菌中.过夜后每个sgRNA-PX458质粒挑取3个阳性克隆,进行PCR和测序验证.挑选序列正确的BCOR sgRNA-PX458质粒,转染HEK 293T细胞,进行BCOR基因编辑,采用荧光显微镜及流式细胞学观察HEK 293T细胞绿色荧光蛋白表达的情况,确定是否成功及转染效率,提取HEK 293T细胞DNA,PCR扩增BCOR基因的相应片段,进一步Sanger测序验证,鉴定BCOR sgRNA-PX458 CRISPR/Cas9系统对BCOR基因的编辑能力和效率.结果 经测序验证,成功构建了靶向BCOR sgRNA-PX458质粒的CRISPR/Cas9系统,转染HEK 293T细胞后,可见HEK 293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,测序鉴定发现BCOR sgRNA-PX458质粒能够产生插入或者缺失,可以成功编辑BCOR基因.结论 成功构建了靶向BCOR的sgRNA-PX458质粒,可在HEK 293T上成功编辑BCOR基因,为进一步研究BCOR的功能奠定了基础.
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利用CRISPR/Cas9介导基因编辑人类三核受精卵伦理问题探讨
以广州中山大学黄军就博士201 5年发表在Protein & Cell杂志上一篇引起广泛关注和伦理争议的论文为背景,分析了使用CRISPR/Cas9介导基因编辑人类三核受精卵存在的伦理问题,探讨了相关研究终可能导致优生和定制胎儿的后果,评价了此项研究引发的国际国内伦理争论,分析了“先干起来,干了再说”的非理性观点.认为现阶段应对相关研究加以规范,在技术尚不成熟的情况下,不能随意开展人类生殖细胞和人类胚胎基因编辑基础研究,更不能推广到临床研究.
关键词： CRISPR/Cas9技术 基因编辑 人类三核受精卵 人类胚胎 生物医学研究伦理 -
胚胎基因设计的伦理问题研究
CRISPR/Cas9技术是近年来备受瞩目的一项新兴基因编辑技术,对胚胎基因设计的伦理问题展开讨论,反对胚胎基因设计的论证包括:应当禁止父母决定子女未来、应当禁止将子女产品化、应当顺其自然、应当禁止助长歧视、应当禁止不公平分配、应当禁止浪费资源;支持胚胎基因编辑的论证包括:不应当限制人的自由、不应当禁止父母增加子女的幸福、不应当禁止不能禁止的行为等.在当前的时空范围内,“应当禁止胚胎基因设计极可能是正确的道德判断”,但随着大部分人“应对”世界方式的变化,该道德判断的正确性也极可能发生变化.
关键词： CRISPR/Cas9技术 基因增强 胚胎基因设计 生命伦理 -
瘦素蛋白转基因约氏疟原虫对小鼠体质量的影响
目的 探讨含瘦素(leptin)蛋白转基因约氏疟原虫(Plasmodium yoelli)对感染小鼠体质量的影响. 方法 设计并构建含小鼠瘦素基因的疟原虫CRISPR/Cas9重组质粒,该质粒两端带有约氏疟原虫17XNL株巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)的5'和3'同源序列,将外源的小鼠瘦素基因经同源重组插入至MIF基因编码区下游,构建重组质粒PYC-MIF-Leptin.将该重组质粒电转入体外培养的约氏疟原虫成熟裂殖体内,通过尾静脉注射该裂殖体感染雌性昆明小鼠1只,经乙胺嘧啶筛选和PCR鉴定获得转基因约氏疟原虫克隆.将转基因疟原虫和野生型疟原虫感染C57BL/6小鼠各1只,取眼球血和尾静脉血,通过RT-PCR和免疫荧光检测瘦素在疟原虫内是否成功表达.将含转基因疟原虫和野生型疟原虫(1×104接种量)的200μl PBS尾静脉注射感染C57BL/6小鼠各5只,阴性对照组注射等量PBS.每两天记录并统计小鼠原虫血症及体质量变化.采用SPSS 19.0软件进行统计学分析. 结果 构建了含瘦素基因和疟原虫MIF同源重组序列的重组质粒PYC-MIF-Leptin.转基因疟原虫DNA测序结果证实,瘦素基因整合入MIF基因下游,并在疟原虫中成功转录.免疫荧光实验结果表明,转基因疟原虫能够表达小鼠瘦素蛋白.转基因疟原虫组17 d体质量下降尤其明显,为(17.26±1.40)g.野生型疟原虫组和阴性对照组小鼠体质量无明显变化,而转基因疟原虫组体质量下降达10.7％(P＜0.05).两种疟原虫都在原虫血症达到10％左右时开始下降,但是转基因疟原虫增殖速度较快,终在23 d左右均消失. 结论 表达瘦素基因的转基因约氏疟原虫可降低感染小鼠的体质量.
关键词： CRISPR/Cas9技术 转基因 约氏疟原虫 瘦素 体质量下降 -
基于CRISPR/Cas9技术的SRSF9基因敲除对成胶质细胞瘤生物学功能的影响
目的:基于成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats,CRISPR) /Cas9系统构建富含丝氨酸/精氨酸剪切因子9(serine-arginine-rich splicing factor 9,SRSF9)基因敲除的人脑胶质瘤U87稳定细胞株,研究SRSF9在人成胶质细胞瘤中的生物学功能.方法:利用CRISPR/Cas9系统构建3个针对SRSF9基因的单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA),将其转入胶质瘤U87细胞后,采用蛋白质印迹法鉴定SRSF9基因敲除效率.采用有限稀释法挑选出3株SRSF9基因敲除的U87单克隆细胞株并扩增,采用CCK-8法和EdU掺入的FCM法检测细胞体外增殖能力,采用平板克隆形成实验和干细胞成球实验分别检测细胞体外克隆形成和成球的能力,采用裸鼠皮下成瘤实验检测细胞体内成瘤的能力.结果:3条sgRNA成功插入慢病毒载体中,且序列正确.经慢病毒感染效率分析及蛋白质印迹法鉴定证明,SRSF9基因敲除的U87多克隆细胞株构建成功;经蛋白质印迹法和DNA测序确认SRSF9基因敲除的U87单克隆细胞株构建成功,序列发生移码突变.SRSF9基因敲除后,U87单克隆细胞的增殖和克隆形成能力均明显降低(P值均＜0.05),肿瘤干细胞成球能力也明显下降(P＜0.001),而且在裸鼠体内的成瘤能力明显减弱(P＜0.01).结论:成功建立基于CRISPR/Cas9技术的SRSF9基因敲除的脑胶质瘤U87细胞株,并通过功能实验证明SRSF9是成胶质细胞瘤的一个关键致癌基因.
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CHO-S高产量细胞株的新型构建方法及其评价
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是工业生产重组蛋白类生物药物的主要宿主细胞之一.重组蛋白工程细胞株的传统构建方法是通过外源基因的随机整合和多步骤的加压筛选获得,这种方法耗时费力.本研究主要介绍了一种新型的悬浮类型CHO细胞(CHO-S)高产细胞株的构建方法,利用Crispr/Cas9介导的定点整合技术,将重组蛋白编码基因快速、准确地整合到CHO-S细胞基因组中的转录活跃区,实现重组蛋白的高产量表达.采用本方法成功构建得到了高表达单克隆抗体细胞株,并验证了细胞产物质量一致性.
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Crispr/Cas9技术在CHO细胞中进行基因定点敲入的应用
工业生产中,哺乳动物细胞是重组蛋白类药物常用的表达系统之一,但重组细胞株经常在表达量及产品质量方面不尽理想.在基因组中定点整合外源基因则可以极大地改善细胞株的生产能力及产品质量.Crispr/Cas9技术是近年发展起来的基因编辑技术,在动植物细胞中得到了广泛应用.基于已有文献和本实验室经验,本文主要介绍了Crispr/Cas9技术在工业生产常用细胞系中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中进行基因定点整合的方法,并介绍了应用Crispr/Cas9技术进行基因定点敲入的案例.
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Crispr/Cas9技术在CHO细胞中基因敲除的应用
Crispr/Cas9技术是近年发展起来的基因编辑技术,已经在人、动物、植物等各类细胞中得到广泛应用.本文基于文献和本实验室研究成果,介绍了Crispr/Cas9技术在CHO细胞中运用的基本操作方法,以及与重组蛋白表达相关的基因敲除实例,对可能遇到的问题做出了技术解释.笔者认为可利用Crispr/Cas9技术对CHO细胞进行改造以创造出新的工程细胞株,为生物药物开发及生产服务.
关键词： CRISPR/Cas9技术 CHO细胞 向导RNA 生物药物研发 -
lepr和mc4r基因突变斑马鱼的制备及表型分析
肥胖已经成为全球性的公共卫生问题,严重影响人类的身体健康和生活品质.本文运用CRISPR/Cas9技术,构建了肥胖相关基因——瘦素受体(leptin receptor,lepr)和黑素皮质素受体4(melanocortin-4 receptor,mc4r)的斑马鱼突变体,并对其进行形态和功能分析.结果显示,lepr+和mc4r+斑马鱼在胚胎和幼鱼期没有明显异常,但在成年期,lepr-/-和mc4r-斑马鱼相比对照进食增多、体重增加、体脂含量升高,呈现肥胖表型.血糖测定结果显示,饱食喂养条件可以诱导lepr和mc4r-/-成年斑马鱼出现糖耐量受损的现象.进一步地,运用real time RT-PCR对76个能量代谢相关基因在lepr+和mc4r-/-斑马鱼肝脏中转录表达水平进行检测,并与Lepob/ob小鼠肝脏cDNA microarray的数据比较,发现胰岛素/胰岛素样生长因子信号转导通路(insulin/IGF signaling pathway,ISS)相关的基因在lepr-斑马鱼和Lepob/ob小鼠肝脏中表达变化具有较高的正相关性,提示肥胖调控网络在进化中维持了一定的功能保守性.
关键词： 肥胖 斑马鱼 瘦素受体 黑素皮质素受体4 CRISPR/Cas9技术 -
敲除U266细胞株VEGF-A抑制小鼠M2型巨噬细胞迁移的相关研究
目的 初步探索敲除U266细胞株中血管内皮生长因子(VEGF) - A基因及该细胞株对小鼠M2型巨噬细胞迁移的影响.方法 在无菌超净台取6～8周龄C57/B6小鼠骨髓细胞,加入20％L929细胞培养上清(提供M -CSF)的10％1640,体外培养6天左右,获得骨髓来源巨噬细胞MO(BMDMs);流式细胞术检测MO型巨噬细胞标志F4/80/CDllb;TranSWell实验观察不同浓度小鼠VEGF - A对MO型巨噬细胞迁移影响;向MO巨噬细胞中加入脂多糖(LPS)、干扰素(IFN)-γ、小鼠IL-4培养48 h,获得M1、M2型巨噬细胞,流式细胞术分别检测M1、M2型巨噬细胞标志F4/80/CD16/32、F4/80/CD206;CRISPR/Cas9技术敲除U266细胞中VEGF - A,采用嘌呤霉素筛选,再用稀释法进行单克隆筛选,Western blot鉴定敲除成功细胞株,用于后续实验;将敲除成功细胞株与M2型巨噬细胞进行非接触式共培养,观察该细胞株对M2型巨噬细胞迁移影响.结果 体外诱导MO型巨噬细胞表达率为90％以上,Ml型巨噬细胞、M2型巨噬细胞诱导表达率均为90％以上;Transwell实验结果 显示不同浓度小鼠VEGF - A对MO型巨噬细胞迁移能力不全相同(P ＜0. 05);应用Western blot技术已鉴定出VEGF - A敲除成功的U266细胞株及该细胞株能抑制M2型巨噬细胞迁移(P＜0. 05).结论 在体外实验中,CRISPR/Cas9技术敲除U266细胞株中VEGF - A基因后能抑制M2型巨噬细胞迁移.因此,针对调节肿瘤相关巨噬细胞的小分子制剂可能为治疗多发性骨髓瘤提供新的思路.
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TET1基因敲除的宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭能力观察
目的 观察TET1基因敲除的宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭能力.方法 采用CRISPR/Cas9技术构建TET1敲除的Hela细胞株(观察组),同时选择野生Hela细胞作为对照组.采用实时无标记动态细胞分析技术观察两组细胞增殖能力,计算两组90 h时的细胞指数(CI)值;采用Transwell实验观察两组细胞的侵袭能力.结果 观察组、对照组CI值分别为1.04 ±0.86、1.57±1.01,两组相比P＜0.05.观察组、对照组24 h穿膜细胞数分别为(158 ±6)、(109 ±4)个,48 h穿膜细胞数分别为(206±12)、(142 ±7)个,两组相比P均＜0.05.结论 TET1基因敲除的宫颈癌Hela细胞增殖能力、侵袭能力增强.
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CRISPR/Cas9系统在视网膜发育与遗传性视网膜疾病研究中的应用
CRISPR/Cas9系统作为第三代基因编辑工具的代表,操作简便、效率高、成本低,应用前景极其广阔.该系统能够对基因组中特定的核苷酸序列切割,尤其可用于纠正机体的异常基因突变.利用该系统不仅可阐述视网膜发育过程关键基因的调控功能,以及视网膜变性过程中相关信号通路改变的分子机制,更为重要的是运用该系统可修复异常的基因突变.本文主要论述CRISPR/Cas9系统在人类视网膜发育及遗传性视网膜变性疾病发病机制研究中的应用,以及在视网膜变性疾病患者个体化基因治疗方面的应用前景.
关键词： CRISPR/Cas9技术 基因编辑 遗传性视网膜疾病 发育 基因治疗 -
基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌细胞株并分析其增殖特性
目的:基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌(NPC)细胞株,并对该细胞株的增殖特性进行分析.方法:采用RT-PCR及Western blot检测永生化鼻咽黏膜细胞系NP-69及不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z和C666-1中SETD2的表达情况,筛选出SETD2高表达细胞系CNE1.应用CRISPR/Cas9技术敲除CNE1细胞中的SETD2基因,筛选SETD2稳定敲除细胞株.采用CCK-8和平板集落形成实验分析SETD2基因敲除前后CNE1细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期的分布,Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达.结果:与NP-69细胞相比,随着细胞分化程度的降低,SETD2在CNE1、CNE2Z和C666-1细胞中的表达逐渐下降(P<0.01).基于CRISPR/Cas9方法成功地从15个转染了小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)的CNE1细胞单克隆中筛选出2个SETD2稳定敲除的细胞株CNE1-SETD2-KO-#5和#9.CCK-8及平板集落形成实验结果证实,相对于CNE1-WT细胞,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞的增殖能力增强(P<0.05);流式细胞术分析表明,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞G1期减少而G2/M和S期均增加(P<0.05);Western blot证实,SETD2敲除后增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期素D1(cyclin D1)、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)和CDK4表达增加,p21表达减少(P<0.05).结论:基于CRISPR/Ca9技术成功构建SETD2基因敲除NPC细胞株.NPC细胞中SETD2表达与细胞分化程度有关;SETD2表达缺失通过上调cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4并下调p21表达而促进细胞增殖.
关键词： 鼻咽癌 SETD2基因 CRISPR/Cas9技术 基因组编辑 细胞增殖
