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天然产物合成生物学关键技术
结构复杂多样的天然产物是新药发现的重要源泉.通过天然产物合成生物学来实现天然产物的异源合成,被认为是解决复杂、稀缺天然产物来源问题具前景的途径.DNA组装技术与基因组编辑技术是天然产物合成生物学研究的两大关键技术.前者可以将多个元件组装成超长DNA片段,实现代谢途径的重建,后者可以通过底盘基因组的改造,增加底盘与外源途径的适配性.该文综述了DNA组装技术与基因组编辑技术的新研究进展,以期为天然产物合成生物学体系的构建和优化提供帮助.
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CRISPR-Cas 系统介导的基因组编辑和基因转录调控
CRISPR 是一个特殊的 DNA 重复序列家族，其基因结构的主体是由同向重复序列（repeat）与间隔序列（spacer）构成的多段 R-S 结构组成，称为 CRISPR 基因座（CRISPR locus）。在 CRISPR位点的一端存在几组编码蛋白质的基因序列，称为 CRISPR 相关（CRISPR-associated，Cas）基因，其编码的蛋白质称为 CAS 蛋白。利用 CRISPR-Cas9系统对 DNA 分子的靶向切割特性，使其可被用于定向的基因修饰。除用于定点的基因编辑，CRISPR-Cas 系统也可用于干扰目的基因的转录。
关键词： 基因组编辑 基因转录 CRISPR-Cas 系统 -
CRISPR／Cas9技术在儿童期发病的单基因遗传疾病治疗中的应用与前景
成簇规律间隔短回文重复系统相关核酶9（CRISPR／Cas9），是细菌特有的一种获得性免疫系统，近年被改造成新型基因编辑技术。由于其设计简单、操作方便、费用低廉、效率高等特点，已成为靶向基因组编辑工具中的佼佼者，被称为“上帝的剪刀”。 CRISPR－Cas9技术已在基因功能研究、动物模型建立、基因治疗等领域得到广泛应用。本文介绍了CRISPR／Cas9基因组编辑技术的起源、发展、作用机制，疾病基因治疗，特别是在儿童期发病的单基因遗传疾病的新治疗与进展，以期为相关领域的科研人员提供参考。（中华检验医学杂志，2016，39：243－245）
关键词： CRISPR/Cas9系统 基因组编辑 单基因遗传疾病 -
基因组编辑技术新进展及其在消化系肿瘤研究中的应用
基因组编辑技术是位点特异性基因靶向操作的重要工具,研究者可通过该技术实现对感兴趣的目标基因或DNA片段进行“编辑”,实现对靶DNA的定点敲除、敲入等基因组改造.人们已经利用该技术实现包括从低等微生物到人的基因组改造的目标.该技术的应用将在消化系肿瘤早期分期分型、精准治疗和预后判断等方面发挥重要的作用.本文综述了目前较为成熟的以核酸酶为工具的包括类转录激活因子效应物核酸酶、锌指核酸酶以及成簇的规律间隔的短回文重复序列及相关基因在内的多种基因组编辑技术的原理及其在消化系肿瘤研究中的应用新进展.
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CRISPR/Cas9技术及其在药物研发中的应用
CRISPR/Cas9系统是在细菌和古细菌中发现的一种为抵御病毒和质粒的不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制,由规律成簇的间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和Cas (CRISPR-associated)蛋白组成.通过改造简单的Ⅱ型CRISPR系统,将特殊小向导RNA (small guide RNA,sgRNA)和Cas9核酸内切酶导入细胞内,即可在双链DNA特定位置上进行切割并实现基因敲除或敲入.CRISPR/Cas9系统因其高效基因编辑功能,已被应用于多种生物和多项科研领域.本文综合论述了CRISPR/Cas9技术在药物研发中的应用,如功能基因的筛选和定点编辑、药物靶点筛选和验证、动物模型构建和遗传疾病治疗等,总结了CRISPR/Cas9技术目前所存在的缺陷与改善的方向.
关键词： CRISPR/Cas9系统 基因组编辑 耐药性突变 靶点验证 药物研发 -
CRISPR/Cas基因组靶向编辑技术综述
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌特有的一种获得性免疫系统，研究人员将其改造成为靶向基因组编辑的工具，由于操作简单、成功率高且效率高，成为了靶向基因组编辑工具中的佼佼者。同时CRISPR/Cas系统也被改造作为一种极为有效的位点特异性的转录抑制/激活的工具而在研究工作中广泛应用，不仅如此，具有靶向细胞转录过程中产生的RNA底物的利用前景，从而起到与RNAi技术相类似的效果。 CRISPR-Cas技术已经在基因功能研究、动物模型建立、基因治疗等领域得到广泛的推广和应用，有力地推动了相关领域的研究进展。
关键词： 基因靶向修饰技术 Cas9 CRISPR/Cas 基因组编辑 基因治疗 -
可遗传基因组编辑引起的伦理和治理挑战
集中讨论可遗传基因组编辑引起的伦理和治理挑战.首先介绍了可遗传基因组编辑讨论的背景,指出美国科学院的《人类基因组编辑:科学、伦理学和治理》以及英国纳菲尔德生命伦理学理事会的《基因组编辑和人类生殖:社会和伦理问题》这两篇报告的重要意义;然后讨论了反对和支持可遗传基因组编辑的论证,指出了从哲学概念出发的哲学论证与从实际出发的生命伦理学论证之间的区别;后指出在实施可遗传基因组编辑之前必须建立伦理框架和治理安排,并进一步论述了伦理框架和治理安排的初步建议.
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CRISPR系统及其在遗传病治疗中应用的研究进展
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统是细菌和古生菌用于抵抗外源性病毒和质粒入侵的适应性免疫防御系统,近年来遗传工程迅猛发展,CRISPR系统中的Cas9、Cpf1等多种蛋白已被改造为基因组编辑的关键工具.对于由遗传物质发生改变而引起的或者由致病基因突变所控制的遗传病,CRISPR系统已被证实是编辑修正致病基因的有力手段,并有望成为人类遗传病治疗的新策略.本文主要从CRISPR系统的研究进展及其在遗传病治疗中的应用进行综述.
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新一代基因组编辑技术在基因治疗及生物制药领域中的应用
近年来,随着锌指核酸酶、转录激活子样效应因子核酸酶和成簇可调控间隔短回文重复RNA引导核酸酶的出现,“基因组编辑”技术得到广泛应用.由于此类技术具有高效和可定制的特点,在基因治疗、细胞模型、糖基化工程、细胞工程等方面许多新策略、新方法不断涌现,产生了十分重要的影响.本文就近年来基因组编辑技术的发展及其在基因治疗和生物制药领域的应用进行综述.
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基于文献计量的CRISPR-Cas基因组编辑技术可视化分析
目的 从文献计量角度揭示CRISPR-Cas基因组编辑技术(CRISPR-Cas技术)的发展历史、研究现状和前沿趋势,为国内科研和临床人员提供参考. 方法 以Web of Science平台中SCI-Expanded数据库收录的CRISPR-Cas技术主题文献为研究对象,运用HistCite和CiteSpace软件进行统计分析和知识图谱绘制. 结果 CRISPR-Cas技术的文献量呈指数增长趋势,当前研究处于蓬勃发展时期.欧美国家占据领先地位.研究领域以微生物学、生物化学和分子生物学等为主,并逐步向其他学科扩展.早期研究集中于CRISPR-Cas技术的生物学解析,随后应用其进行基因组编辑成为主流.对哺乳动物细胞的基因组编辑、不同基因组编辑技术的对比和技术原理的探索等构成CRISPR-Cas技术的研究前沿. 结论 CRISPR-Cas技术在短时间内取得惊人发展和广泛应用,未来有望在生命科学领域发挥更为深远的影响.
关键词： CRISPR-Cas 基因组编辑 文献计量 可视化 -
CRISPR-Cas9基因编辑技术在眼科疾病中的应用
规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)及相关核酸内切酶9(CRISPR associated protein,Cas9)技术是一种由RNA指导核酸内切酶的基因编辑技术.该技术以其操作简便、基因敲除效率高、靶向精准、周期短等特点迅速被用于多个物种的基因组编辑及疾病基因治疗中.本文旨在对CRISPR-Cas9技术在构建眼科疾病模型和治疗眼科疾病中的应用进展进行综述.
关键词： CRISPR-Cas9 基因组编辑 基因治疗 眼科疾病 -
CRISPR-Cas9技术在人类疾病治疗中的潜在应用
CRISPR-Cas9的发明为生物学领域带来一场新的技术革命。 CRISPR-Cas系统是一种存在于多种细菌和古菌内针对外源遗传物质侵袭的获得性免疫系统，由规律性重复短回文序列簇及其相关蛋白组成。近年该系统被发展成一种由CRISPR相关RNA介导的Cas9核酸内切酶靶向基因编辑技术，在科研、医学及生物技术等多个领域上被广泛应用。 CRISPR-Cas9技术多功能及可编程特点，令其在动物模型制备、物种改良等方面取得重要应用。同时在遗传性疾病、恶性肿瘤、感染性疾病等许多疾病的研究、治疗及预防上均显示出巨大应用潜力。
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CRISPR 系统结构及功能的研究
规律簇集间断的短回文重复序列系统，即 CRISPR 系统，是古生菌及细菌中的一种有效的抵御外来噬菌体或质粒侵袭的获得性免疫系统。迄今为止，科学家们发现了3种 CRISPR 系统，其基本结构包括前导序列、 CRISPR 基因座及 Cas 蛋白家族。完整的 CRISPR 系统可以有效的进行 RNA 介导的位点特异性的双链 DNA 的剪切。近的研究热点是将该体系改造为一种简单有效而快速的基因编辑工具对特定位点的DNA 进行编辑。利用这一技术，我们可以加快单基因研究的进程，可以同时改变多种基因，从而便于研究它们之间的相互作用，并且可以快速有效的建立人类疾病模型鼠。在分子生物学方法学上，这是一个具有里程碑意义的事件。
关键词： 规律簇集间断的短回文重复序列 人工核酸酶 基因组编辑 -
基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌细胞株并分析其增殖特性
目的:基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌(NPC)细胞株,并对该细胞株的增殖特性进行分析.方法:采用RT-PCR及Western blot检测永生化鼻咽黏膜细胞系NP-69及不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z和C666-1中SETD2的表达情况,筛选出SETD2高表达细胞系CNE1.应用CRISPR/Cas9技术敲除CNE1细胞中的SETD2基因,筛选SETD2稳定敲除细胞株.采用CCK-8和平板集落形成实验分析SETD2基因敲除前后CNE1细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期的分布,Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达.结果:与NP-69细胞相比,随着细胞分化程度的降低,SETD2在CNE1、CNE2Z和C666-1细胞中的表达逐渐下降(P<0.01).基于CRISPR/Cas9方法成功地从15个转染了小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)的CNE1细胞单克隆中筛选出2个SETD2稳定敲除的细胞株CNE1-SETD2-KO-#5和#9.CCK-8及平板集落形成实验结果证实,相对于CNE1-WT细胞,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞的增殖能力增强(P<0.05);流式细胞术分析表明,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞G1期减少而G2/M和S期均增加(P<0.05);Western blot证实,SETD2敲除后增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期素D1(cyclin D1)、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)和CDK4表达增加,p21表达减少(P<0.05).结论:基于CRISPR/Ca9技术成功构建SETD2基因敲除NPC细胞株.NPC细胞中SETD2表达与细胞分化程度有关;SETD2表达缺失通过上调cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4并下调p21表达而促进细胞增殖.
关键词： 鼻咽癌 SETD2基因 CRISPR/Cas9技术 基因组编辑 细胞增殖 -
基于CRISPR-Cas9定向编辑TRAC基因的研究
目的 针对人源TCRα C基因(TRAC)进行CRISPR/Cas9-gRNA的设计,并验证设计的gRNA的有效性及其脱靶率.方法 利用CRISPR网站(http://crispr.mit.edu/)提供的靶向编辑位点筛选工具,针对TCRα C区各设计出了3个编辑位点,并据此构建CRISPR-Cas9-TCR敲除质粒,将构建好的质粒转染293T细胞系,通过流式细胞术结合PCR产物的T-A克隆测序等方法验证各个gRNA序列的编辑效率.再根据所预测的潜在脱靶位点,设计相应的上下游引物进行PCR扩增后测序,检测其是否出现脱靶.结果 在3组针对TCRα C区的gRNA中,site2-gRNA的编辑效率高,并且无脱靶现象.结论 针对人源TCRα C基因设计的site2-gRNA对TCRα C区具有很好的编辑效果,且无脱靶现象,为消除杂合TCR分子的产生和改善TCR修饰的T细胞(TCR-T)过继性免疫治疗奠定了基础.
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CRISPR/Cas9技术在HepG2基因组中进行定点基因突变的探索
目的：探索利用CRISPR/Cas9技术在细胞株HepG2基因组中进行定点突变。方法设计并构建靶向核受体LRH-1和ERRα基因组序列的gRNA质粒。将构建好的gRNA质粒和hCas9质粒转染HepG2细胞后，PCR扩增HepG2基因组中LRH-1和ERRα基因的突变位点，并用SURVEYOR法检测突变情况。结果靶向核受体LRH-1和ERRα基因组序列的gRNA质粒构建成功。HepG2细胞经gRNA-LRH-1/gRNA-ERRα和hCas9转染后，针对LRH-1和ERRα的突变位点基因组序列的PCR产物经SURVEYOR法检测结果显示出现两条与预计大小相符的电泳条带。结论在HepG2细胞中成功利用CRISPR/Cas9技术介导的基因组编辑对LRH-1和ERRα特定基因组序列产生突变，为构建其细胞株敲除模型奠定了基础。
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第三代基因组编辑技术--CRISPR/Cas9的研究进展
规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)是细菌和古细菌为应对病毒和质粒的攻击演化而来的获得性免疫防御机制。Cas9蛋白可在sgRNA 的指导下对靶基因进行位点专一的双链断裂,细胞借助同源重组机制或非同源末端连接机制对断裂的 DNA 进行修复。CRISPR/Ca59技术简单、高效、精准,可进行多重靶向修饰,已成为继锌指核酸酶及TALE 核酸酶之后的第三代基因组靶向修饰工具,并显示出巨大的优势及广泛的应用前景。本文就对CRISPR/Cas9技术的发展、生物学机制、应用前景尤其是在单基因遗传病基因治疗方面的研究进行阐述,以期为相关领域的研究提供参考。
关键词： CRISPR/Cas9 基因组编辑 脱靶效应 基因治疗
