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CRISPR/Cas9系统——靶向基因组编辑的新策略
CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统.Ⅱ型CRISPR/Cas系统经人工改造为由Cas9核酸酶和特异的sgRNA构成的新型靶向基因组编辑技术,即CRISPR/Cas9系统.与锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)相比,CRISPR/Cas9系统操作简单,花费低,编辑功能更强.本文综述了CRISPR/Cas9系统的基本结构、作用机制和应用进展,并对其应用前景进行了展望.
关键词： CRISPR/Cas9系统 靶向基因组编辑 分子靶向治疗 脱靶效应 综述 -
利用CRISPR/Cas9系统抑制Kan耐药基因水平转移研究
目的 研究细菌耐药基因水平转移的控制技术.方法 以卡那霉素耐药基因Kan为靶基因设计3组靶向sgRNA,分别退火后插入到pCas9质粒中,重组菌用氯化钙法制成感受态,将含有Kan耐药基因的质粒pET-30a向其转化,转化菌液分别涂布含氯霉素和含氯霉素/卡那霉素平板,比较各组转化效率.将携带Kan特异性sgRNA的重组质粒分别转化含pET-30a的大肠埃希菌,PCR检测Kan耐药基因的降解,并绘制转化子在氯霉素平板上的生长曲线以分析特异性sgRNA对受体菌生长的影响.结果 所设计的3组sgRNA中有2组可以介导CRISPR/Cas9系统对Kan耐药基因水平转移的完全抑制,其余1组也可使转移效率降低88.08%.抑制机制为特异性CRISPR/Cas9系统降解了Kan耐药基因.未发现3组sgRNA对受体菌生长有明显影响.结论 特异性CRISPR/Cas9系统可抑制细菌Kan耐药基因的水平转移.
关键词： CRISPR/Cas9系统 细菌耐药性 水平基因转移 -
CRISPR／Cas9技术在儿童期发病的单基因遗传疾病治疗中的应用与前景
成簇规律间隔短回文重复系统相关核酶9（CRISPR／Cas9），是细菌特有的一种获得性免疫系统，近年被改造成新型基因编辑技术。由于其设计简单、操作方便、费用低廉、效率高等特点，已成为靶向基因组编辑工具中的佼佼者，被称为“上帝的剪刀”。 CRISPR－Cas9技术已在基因功能研究、动物模型建立、基因治疗等领域得到广泛应用。本文介绍了CRISPR／Cas9基因组编辑技术的起源、发展、作用机制，疾病基因治疗，特别是在儿童期发病的单基因遗传疾病的新治疗与进展，以期为相关领域的科研人员提供参考。（中华检验医学杂志，2016，39：243－245）
关键词： CRISPR/Cas9系统 基因组编辑 单基因遗传疾病 -
应用CRISPR/Cas9技术构建MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株
目的 运用成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术,构建线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,研究MAVS对细胞生长的影响.方法 针对MAVS基因第一外显子设计小向导RNA(sgRNA),构建pX459-sgRNA重组质粒.然后利用嘌呤霉素筛选ZR-751 MAVS基因敲除的阳性克隆,Western印迹检测MAVS基因敲除情况,提取克隆基因组进行测序鉴定.平板克隆实验检测MAVS被敲除后对细胞增殖的影响,再利用MTS实验检测在DFX培养基刺激下,MAVS对细胞死亡的影响.结果 Western印迹结果说明ZR-751细胞株内MAVS已完全敲除;且在凋亡诱导剂DFX刺激下,MAVS被敲除后促进细胞增殖.结论 利用CRISPR/Cas9系统成功构建了MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,初步实验提示MAVS抑制乳腺癌细胞生长,为后续研究MAVS在肿瘤中的功能奠定了基础.
关键词： 线粒体抗病毒信号蛋白 CRISPR/Cas9系统 基因敲除 乳腺肿瘤 嘌呤霉素 -
基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的RIP1稳定敲除细胞模型的构建及功能研究
目的 利用CRISPR/Cas9技术构建RIP1稳定敲除的人永生化表皮细胞HaCaT细胞株,在此基础上对RIP1功能进行探究.方法 针对GenBank中RIP1基因序列,设计靶向RIP1不同外显子的小指导RNA(sgRNA),并将其克隆至SpCas9-2A-Puro V2.0(PX459)载体中,获得PX459-sgRNA基因敲除载体.将上述载体转染HaCaT细胞并通过嘌罗霉素筛选获得阳性克隆,免疫印迹和DNA测序技术进一步鉴定RIP1敲除效果佳的单克隆.通过CCK-8实验检测RIP1缺失对细胞增殖能力的影响.分别用TNF-α处理HaCaTWT细胞和HaCaTRIP1KO细胞,流式细胞仪检测敲除RIP1对TNF-α诱导细胞死亡的影响,进一步通过胱天蛋白酶(caspase)抑制剂Z-VAD-FMK判断细胞死亡类型.结果与结论 利用 CRISPR/Cas9 系统成功构建 RIP1 完全敲除的细胞模型,功能分析发现敲除 RIP1导致细胞增殖能力减慢;HaCaTRIP1KO对 TNF-α诱导的死亡异常敏感,这种死亡能被 Z-VAD-FMK 显著抑制,证明为caspase 依赖性细胞凋亡.该研究为探究 RIP1 在皮肤损伤中的作用奠定了基础.
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利用CRISPR／Cas9系统构建H22细胞GP73基因敲除稳定株及功能鉴定
目的：利用CRISPR／Cas9基因编辑系统敲除小鼠源肝癌细胞H22中的GP73基因，构建H22细胞GP73基因敲除的稳定细胞株。方法根据CRISPR／Cas9靶点设计原则，设计2条特异性识别GP73基因启动子的上下游sgRNA，利用载体pX459质粒，构建2对重组真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后，将重组质粒转染至H22细胞内，使用嘌罗霉素加压筛选稳定敲除GP73的H22细胞株，利用免疫印迹检测重组质粒对内源GP73的敲除效果。MTT实验检测GP73被敲除后对细胞增殖能力的影响，再利用划痕实验检测细胞的迁移能力。结果免疫印迹结果说明敲除GP73基因的小鼠源H22细胞株内无GP73蛋白的表达；并且GP73被敲除后，H22细胞的增殖能力和迁移能力减慢。结论通过CRISPR／Cas9系统获得了靶向GP73基因的重组质粒，并且筛选出了稳定干扰GP73表达的细胞株，从而为探讨GP73在肝癌发生中的作用奠定基础。
关键词： CRISPR/Cas9系统 GP73 基因敲除 癌 肝细胞 -
CRISPR/Cas9技术及其在药物研发中的应用
CRISPR/Cas9系统是在细菌和古细菌中发现的一种为抵御病毒和质粒的不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制,由规律成簇的间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和Cas (CRISPR-associated)蛋白组成.通过改造简单的Ⅱ型CRISPR系统,将特殊小向导RNA (small guide RNA,sgRNA)和Cas9核酸内切酶导入细胞内,即可在双链DNA特定位置上进行切割并实现基因敲除或敲入.CRISPR/Cas9系统因其高效基因编辑功能,已被应用于多种生物和多项科研领域.本文综合论述了CRISPR/Cas9技术在药物研发中的应用,如功能基因的筛选和定点编辑、药物靶点筛选和验证、动物模型构建和遗传疾病治疗等,总结了CRISPR/Cas9技术目前所存在的缺陷与改善的方向.
关键词： CRISPR/Cas9系统 基因组编辑 耐药性突变 靶点验证 药物研发 -
利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系
目的:利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系.方法:设计针对敲除CBX2的short guide RNA(sgRNA),并克隆到载体PX459中.将测序正确的重组质粒转染到A549细胞中,利用嘌呤霉素筛选转染阳性细胞并分离得到5个单克隆细胞系,通过Western blot方法检测构建的细胞系中CBX2蛋白表达情况.结果:成功构建了靶向CBX2的CRISPR/Cas9重组质粒,筛选出的5个单克隆细胞系中CBX2蛋白表达水平均显著下降.结论:成功利用CRISPR/Cas9系统构建了稳定敲除CBX2基因的A549细胞系.
关键词： CBX2基因 CRISPR/Cas9系统 基因敲除 -
CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除HuT-78细胞PD-1分子对其增殖能力的影响
利用CRISPR/Cas9技术成功敲除人T细胞系HuT-78细胞中编码Pn-1分子的基因PDCD1,并比较敲除了PDCD1基因的及对照组的HuT-78细胞增殖能力的差异.实验结果显示敲除PDCD1基因的HuT-78细胞的增殖能力不受PD-L1的影响,为将此技术应用于肿瘤免疫治疗提供了实验依据.
关键词： CRISPR/Cas9系统 PDCD1基因 HuT-78细胞 -
利用sgRNA串联表达框架编辑恶性疟原虫K13和NUP116基因的研究
目的 利用单链引导RNA (sgRNA)串联表达框架编辑恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)K13和NUP116基因.方法 根据恶性疟原虫K13和NUP116基因序列设计引物,PCR扩增K13和NUP116基因的同源臂,并引入突变位点.PCR串联基因K13和NUP116的sgRNA,将同源臂和串联的sgRNA与载体pL6cs连接,构建用于电击转染实验的载体pL6-K13-NUP116,将其与表达Cas9蛋白的质粒一同通过电击转染法,转入恶性疟原虫体内,利用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9 (CRISPR/Cas9)系统对基因进行编辑修饰,通过筛选药物二氢叶酸还原酶抑制剂(WR)和杀稻瘟菌素(BSD)筛选转基因疟原虫,提取转基因疟原虫的基因组,对其进行PCR检测,终通过测序鉴定K13和NUP116基因是否成功被突变修饰.结果 PCR扩增出K13和NUP116串联的同源臂(K13全长557 bp,NUP116全长569 bp)以及串联的sgRNA,与载体pL6cs连接后成功获得用于电击转染实验的表达载体pL6-K13-NUP116.电击转染后通过药物筛选转基因疟原虫,培养至第28天涂片镜检发现疟原虫.PCR检测结果显示,转基因疟原虫K13和NUP116基因突变修饰成功.测序表明,K13和NUP116基因的目标位点被成功突变.结论 基于CRISPR/Cas9编辑技术的串联sgRNA表达载体可同时对恶性疟原虫K13和NUP116基因进行编辑.
关键词： 恶性疟原虫 CRISPR/Cas9系统 基因编辑 -
CRISPR/Cas9系统在寄生虫领域的研究进展
CRISPR/Cas9是一种有效的基因组靶向修饰系统,能够实现对基因组特定位点的基因敲除、定点插入和基因修复等遗传操作,为寄生虫的基因功能分析、药物靶点和疫苗分子筛选等研究提供了技术创新平台.本文对CRISPR/Cas9系统的原理及其在刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、疟原虫(Plasmodium)、锥虫(Trypanosoma)和利什曼原虫(Leishmania)等重要寄生虫研究中的新进展进行综述,分析讨论现阶段该系统在寄生虫研究应用方面存在的问题和优化策略.
关键词： CRISPR/Cas9系统 基因编辑 寄生虫 -
应用CRISPR/Cas9技术构建IL-15敲除的MGC-803胃癌细胞株
目的:运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立IL-15基因敲除的MGC-803胃癌细胞株.方法:针对IL-15基因作用的功能域,设计了靶向IL-15基因Exon2的gRNA.构建PX458-gRNA重组质粒并转化感受态细胞Stbl3,筛选出重组子后进行测序,通过测序确认了所设计的gRNA的有效性.并进一步通过流式细胞分选以及ELISA法检测筛选出的MGC-803胃癌细胞株IL-15基因的表达水平.结果:测序结果显示敲除质粒构建成功,与阴性对照组相比,转染PX458-IL-15-gRNA质粒组IL-15的表达水平明显低于阴性对照组,差异具有统计学意义(P＜ 0.001).结论:利用CRISPR-Cas9系统成功构建了IL-15基因敲除的MGC-803细胞,为后续研究IL-15在肿瘤中的作用机制和功能奠定了基础.
关键词： IL-15 CRISPR/Cas9系统 基因敲除 -
CRISPR/Cas9系统在人类疾病中的研究应用进展
规律成簇的短回文重复序列(clustered regularly intespaced short palindromic repeats,CRISPR)/(CRISPR associated 9,Cas9)基因编辑技术是由细菌中的获得性免疫系统发展而来的,作为目前有效受欢迎的基因编辑工具,Cas9蛋白可在向导RNA的引导下对DNA进行定点切割,与转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)和锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)相比效率更高且成本更低.CRISPR/Cas9编辑系统应用于人类疾病研究,有望解决生命科学研究领域多种复杂的分子生物学难题,例如癌症.本文主要从人类疾病的基因治疗出发,重点介绍了该技术在各系统中疾病模型的建立以及在遗传疾病的治疗、病毒感染性疾病治疗、癌症研究等方面的应用,并讨论了这种先进分子技术的未来前景和尚存在的不足.
关键词： CRISPR/Cas9系统 基因编辑 人类疾病 -
利用CRISPR/Cas9技术建立NOD/SCID/IL2Rγ-/-免疫缺陷小鼠
目的 NOD/SCID/IL2Rγ-/-(NSG)小鼠品系是严重的免疫缺陷品系,广泛应用于异种移植的研究.然而,SCID突变是Prkdc基因的一个自发性突变,会导致T细胞发育阻滞后渗漏而且很难进行基因型鉴定.因此,开发一个敲除Prkdc和IL2Rγ基因的新品系NSG小鼠非常重要.方法 使用CRISPR/Cas9系统实现Prkdc和IL2R基因的靶向敲除.将基因敲除小鼠与NOD背景小鼠杂交,我们产生了新品系NOD/SCID/IL2Rγ-/-(NSG)小鼠,称为cNSG(中国NSG)小鼠.结果 cNSG小鼠完全缺乏T细胞,B细胞以及NK细胞而且表达NOD突变.体内成瘤实验证实cNSG鼠是一种比免疫缺陷裸鼠更有效的异种移植模型.结论 cNSG小鼠与Jackson实验室的NSG鼠的免疫缺陷一致,有望成为中国生物医学研究的重要异种移植模型.
关键词： 基因工程 CRISPR/Cas9系统 免疫缺陷小鼠 cNSG品系 移植 -
利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除4.1R基因的RAW264.7细胞株
目的 利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除4.1R基因的RAW264.7巨噬细胞株,为研究4.1R在巨噬细胞中的功能奠定基础.方法 根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别4.1R基因的向导RNA(sgRNA),构建sgRNA-lentiCRISPRv2重组质粒并转入293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒侵染RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并稀释至单克隆,Western blotting印记检测单克隆细胞中蛋白4.1R的表达,测序确认单克隆细胞中突变位点.结果 Western blotting印迹检测结果表明筛选出的1株单克隆细胞中蛋白4.1R的表达完全缺失;测序结果表明该细胞株中4.1R基因发生了19bp的缺失突变;并且4.1R基因敲除后,RAW264.7细胞的增殖能力显著增加.结论 本研究利用CRISPR/Cas9系统成功的干扰了巨噬细胞系RAW264.7细胞中4.1R的表达,为研究4.1R在巨噬细胞中的功能提供了有效工具.
关键词： CRISPR/Cas9系统 4.1R 基因敲除 RAW264.7细胞 -
CRISPR/Cas9系统的脱靶效应及其介导的非编码RNA编辑在人类癌症中的应用
成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR蛋白9(Cas9)系统作为细菌对抗外源入侵DNA的防御机制已经被成功开发应用于真核生物基因组编辑,该系统具有高效准确且可以编辑任意DNA位点的特点,同时也存在较为严重的脱靶效应.癌症目前对于人类依然是严峻挑战,癌症治疗过程中的不良反应使患者十分痛苦,CRISPR/Cas9系统可能实现在基因水平治疗癌症.本文旨在探讨CRISPR/Cas9系统的脱靶效应,为肿瘤治疗的深入研究提供新思路.
关键词： 肿瘤 CRISPR/Cas9系统 脱靶效应 非编码RNA -
利用CRISPR/Cas9慢病毒系统构建肺部EZH2基因敲除小鼠
背景与目的 已有的研究证明CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated 9)系统是一种能够在哺乳动物细胞中高效操作的新型基因编辑技术,应用人工设计的向导RNA (single-guide RNA, sgRNA)介导外源表达的Cas9蛋白与靶点DNA特异性结合以实现对基因组DNA的切割,被切割后的基因组DNA通过非同源重组或同源重组的方式进行修复,从而实现基因的敲除、或者外源基因的敲入等目标.本研究的目的是应用CRISPR/Cas9技术构建小鼠肺部EZH2基因敲除的动物模型.方法 针对EZH2基因的编码区,设计两个靶向EZH2基因Exon3和Exon4的sgRNA,通过慢病毒包装、感染细胞、SURVEYOR assay等一系列体外实验,验证所设计的sgRNA的有效性.应用支气管插管的方式把慢病毒灌注到小鼠肺部,利用免疫组化方法和qRT-PCR进行检测.结果 NIH-3T3细胞的体外实验结果验证了实验所设计的sgEZH2能够有效地在体外细胞系中介导Cas9切割靶DNA;小鼠支气管插管实验及肺部组织免疫组化和qRT-PCR方法检测EZH2基因敲除的效率,发现实验组小鼠肺部组织EZH2表达明显降低.结论 本研究成功设计了两条能够敲除EZH2功能的sgRNA,并应用CRISPR/Cas9技术成功建立了肺部EZH2基因敲除的小鼠模型,为研究EZH2的功能和作用机制提供了有效的动物模型.
关键词： CRISPR/Cas9系统 EZH2 sgRNA 基因敲除 -
共享CRISPR/Cas9成果，谱写医学发展新篇章
2014年CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，成簇的规律间隔的短回文重复系列区域）基因工程编辑技术的公布，在整个医学生物研究领域，引起了席卷世界的一场“风暴”。CRISPR/Cas9系统基因编辑技术现已用于医学、生物学、农业、渔业等各行各业，而且揭示出了它的创新革命前景。目前该项技术在医学领域用于构建动物疾病模型、人肝癌小鼠模型、基因治疗与预防、生物物种的改良、解密人类基因功能、促进组织和器官再生、与诱导多能干细胞（IPS）技术等相结合，使修复后的IPS重新发展成正常的组织和器官，供患者移植。随着研究的深入，有可能通过CRISPR/Cas9系统对人类社会基因进行扫描，定位并治愈疾病。
关键词： CRISPR/Cas9系统 基因编辑 基因切除 基因缺失
