首页 > 文献资料
-
疟原虫配子体蛋白Pys48核酸疫苗的构建与免疫活性观测
为探讨约氏疟原虫配子体蛋白Pys48核酸疫苗的免疫效果及其效应,以约氏疟原虫Pys48全基因序列克隆和真核表达载体pcDNA3.1+为基础获得核酸重组质粒,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中特异性抗体水平,并通过IFA检测疫苗的免疫活性以及免疫血清对有性阶段虫体发育的阻断效应.测序结果和酶切鉴定均证实构建的质粒为Pys48全基因插入质粒.ELISA结果显示疫苗免疫小鼠血清特异性抗体滴度明显高于对照组;IFA结果显示免疫血清能够明显阻断配子体向合子与动合子的发育,并且其传播阻断效应与免疫血清呈剂量依赖性关系.实验表明,真核表达载体pcDNA3.1+表达的Pys48核酸疫苗具有良好的免疫原性,其免疫血清可显著抑制有性阶段原虫的进一步发育.
关键词： 约氏疟原虫 Pys48 核酸疫苗 免疫血清 传播阻断 -
鼠疟模型作为恶性疟原虫多表位疫苗保护性的探索试验
目的：为寻找恶性疟原虫基因工程多表位疫苗保护性评价的模型动物，利用小鼠约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)及小鼠伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)模型对本实验室构建的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)多阶段、多表位基因工程候选疫苗进行了体内保护性及免疫模式探索试验。结果在约氏疟原虫模型，先用该疫苗基因的大肠杆菌表达蛋白免疫，后用含同一基因的重组痘苗病毒加强免疫组，与野生型痘苗病毒免疫组及空白对照组相比，小鼠的死亡时间延长(P<0.01)。结果初步显示，约氏疟原虫鼠疟模型可用作该基因工程多表位恶性疟原虫候选疫苗的保护性评价。
-
约氏疟原虫感染小鼠的巨噬细胞表面吞噬相关分子的研究
为探讨致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL)感染抵抗型DBA/2小鼠的脾巨噬细胞发挥吞噬功能的作用机制,本试验利用Giemsa薄血膜染色,光学显微镜计数红细胞感染率,观察巨噬细胞的吞噬功能;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清中抗P.y.17XL特异性IgG抗体水平;采用流式细胞技术(FACS)动态检测脾巨噬细胞表面膜分子CD36、CD64表达水平.结果表明,DBA/2小鼠红细胞感染率于感染后第7天高达31.87%,约第15天自愈;感染小鼠脾巨噬细胞吞噬能力于感染后第5天开始增强,至第10天吞噬率高达95%,随后维持于高水平;巨噬细胞表面分子CD36于感染后第3天开始升高,至第10天达到峰值;CD64表达水平于感染后第5天开始升高,随后持续维持于高水平;小鼠血清中抗P.y.17XL特异性IgG抗体水平在感染后第10天开始出现有意义的升高.结果显示,在P.y.17XL感染过程中,巨噬细胞通过表面分子CD36和CD64分别介导的非调理性和调理性吞噬方式杀伤疟原虫,提示巨噬细胞是DBA/2小鼠发挥抗疟保护性免疫的重要效应细胞.
-
鼠疟原虫感染过程中IFN-γ对MΦ合成NO诱导作用的体外实验研究
为探讨疟原虫感染过程中IFN-γ对巨噬细胞合成NO的诱导作用,我们应用Griess反应检测了约氏疟原虫感染小鼠脾细胞和MΦ培养上清中NO的分泌情况.结果显示,去除淋巴细胞则脾细胞中的MΦ合成NO水平显著下降;外源性IFN-γ的加入可明显地提高MΦ合成NO的水平.这表明,在约氏疟原虫感染过程中,淋巴细胞的存在能促进MΦ合成NO;IFN-γ是促进MΦ合成NO的一种主要细胞因子.
-
疟原虫雌性配子体特异性表面蛋白Pys47真核表达及免疫效应评价
P47是特异性表达于疟原虫雌性配子体以及雌性配子表面的蛋白,为了评价其作为传播阻断疫苗候选抗原的免疫效果及其效应,本研究将约氏疟原虫Pys47完整编码区基因序列克隆入真核表达载体pcDNA3.1+,获得核酸质粒,肌肉注射BALB/c小鼠.通过ELISA方法检测免疫小鼠血清滴度,IFA检测疫苗的免疫活性以及免疫血清对有性阶段虫体发育的阻断效应.测序结果和酶切鉴定证实构建的质粒与要求相符;ELISA结果显示免疫小鼠血清特异性抗体滴度明显高于对照组;IFA结果显示免疫血清未能明显阻断配子体向合子与动合子的发育.因此,本实验提示作为疟原虫有性阶段特异性表达蛋白P47,可能不是一个理想的疟原虫传播阻断疫苗候选抗原.
-
约氏疟原虫感染早期易感和抵抗小鼠树突状细胞亚群和表型的变化特点
为探讨致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL,P.y,17XL)感染早期,树突状细胞(Dendritic cellg,DCs)亚群和表型的变化特点,本试验利用P.y,17XL感染易感的BALB/c和抵抗的DBA/2小鼠,制备感染前和感染后第3、5天小鼠脾细胞悬液,采用流式细胞分析技术检测2种小鼠脾细胞悬液中髓样DCs和浆样DCs的数量以及表面表达MHCⅡ类分子和CD80分子的DCs的百分含量.结果表明,BALB/c小鼠和DBA/2小鼠分别呈现以浆样DCs和髓样DCs为主的增殖模式;2种小鼠表面表达MHCⅡ类分子的DCs的数量均于感染后第3天开始明显升高,在第5天达到高水平,但BALB/c小鼠的表达水平明显低于DBA/2小鼠;DBA/2小鼠表面表达CD80分子的DCs的数量在感染后第3～5天呈逐渐增高趋势,其水平明显高于BALB/c小鼠.而BALB/c小鼠表面表达CD80分子的DCs的数量仅在感染后第5天出现有意义的升高.结果显示,P.y,17XL感染早期,BALB/c和DBA/2小鼠在DCs亚群的增殖模式、成熟表型特征性分子的表达水平和时相上均存在显著差异.
-
大劣按蚊血淋巴中疟原虫感染相关蛋白的cDNA克隆
疟疾是一种严重的传染病,大劣按蚊是我国及东南亚地区的重要传疟媒介.对大劣按蚊抗疟原虫感染分子机制的研究,具有重要意义.我们先前已成功分离了大劣按蚊血淋巴中约氏疟原虫感染相关蛋白(PIRP1),并对该蛋白进行了质谱检测.本研究在已获得PIRP1质谱检测信息的基础上,利用分子生物学技术,成功克隆了该相关蛋白的部分cDNA序列(CenBank序列号为EF409973).为下一步对该蛋白的功能研究奠定了基础.
关键词： 大劣按蚊 约氏疟原虫 克隆 约氏疟原虫感染相关蛋白PIRP1 血淋巴 -
约氏疟原虫感染大鼠肝脏、腹腔巨噬细胞B7.1、B7.2、TGF-β、IFN-γ基因表达研究
建立约氏疟原虫--斯氏按蚊--哺乳动物模型,在感染约氏疟原虫后2 h、12 h、24 h、48 h、72 h分别提取大鼠肝脏和腹腔巨噬细胞总RNA,通过RT-PCR定量分析发现在宿主体感染约氏疟原虫后2～72 h时间段内,B7.1表达水平没有变化,而B7.2、TGF-β、IFN-γ转录水平显著上调.该现象提示疟原虫子孢子入侵引起宿主体内免疫相关基因B7.1、B7.2、TGF-β、IFN-γ mRNA转录水平发生改变,可能与哺乳动物机体针对疟原虫感染产生的免疫防御、免疫调控密切相关.
-
疟疾传播阻断疫苗Pys25重组蛋白免疫活性的实验研究
为探讨约氏疟原虫传播阻断疫苗Pys25重组蛋白的免疫效果及其效应,我们以酵母菌表达的Pys25重组蛋白皮下免疫DBA/2小鼠,采用ELISA检测免疫后不同时间小鼠血清中的特异性抗体水平,并通过IFA观察免疫血清对有性阶段虫体发育的阻断效应.初次免疫后2周,小鼠血清中特异性IgG抗体水平开始升高,并于加强免疫后2周达到峰值;感染血液与免疫血清共同培养后,配子体向合子和动合子的发育明显受阻,并且其传播阻断效应与免疫血清呈剂量依赖性.实验表明,酵母菌表达的Pys25重组蛋白具有良好的免疫原性,其免疫血清可显著抑制有性阶段原虫的进一步发育.
-
约氏疟原虫感染早期抵抗和易感小鼠Th1反应特点的实验研究
为探讨疟原虫感染早期抵抗和易感小鼠Th1反应特点,以约氏疟原虫腹腔感染DBA/2和BALB/c小鼠为材料,用ELISA试剂盒和Griess实验分别检测感染第3天小鼠脾细胞、悬浮细胞以及巨噬细胞培养上清液中IFN-γ和NO水平.结果表明以PRBC或LPS刺激后,DBA/2小鼠脾细胞上清液中IFN-γ和NO水平随培养时间的延长均有不同程度的提高,但BALB/c小鼠48 h培养组的IFN-γ和NO水平仅比24 h培养组略有升高.两种小鼠单纯悬浮细胞或巨噬细胞上清液中IFN-γ或NO水平均明显低于其脾细胞上清液中的水平.这表明,约氏疟原虫感染早期,抵抗宿主对特异性或非特异性因子刺激的应答能力明显强于易感宿主,在相同因子刺激下前者建立的Th1反应可进一步被强化;巨噬细胞分泌NO明显依赖于IFN-γ的诱导效应.
-
大劣按蚊感染约氏疟原虫血淋巴相关蛋白的筛选和鉴定
目的 筛选并鉴定大劣按蚊感染约氏疟原虫后血淋巴的相关蛋白,为进一步的功能研究和蚊先天性免疫研究奠定基础.方法 以大劣按蚊- 约氏疟原虫为实验模型,利用二维电泳技术分离和比较饱吸约氏疟原虫感染的鼠血和正常鼠血后24 h 的大劣按蚊血淋巴蛋白,获得差异蛋白,并对差异蛋白进行N端氨基酸测序和生物信息学分析,从而推测差异蛋白的功能.结果 获得清晰二维电泳图,并筛选获得37个差异蛋白点.对其中比较明显的差异蛋白1进行氨基酸测序后发现,该蛋白可能为一翻译延伸因子.结论 成功分离和筛选获得了大劣按蚊感染约氏疟原虫血淋巴相关蛋白,并进行了初步鉴定.
-
约氏疟原虫动合子的体外纯培养
目的探讨提纯的约氏疟原虫合子培养形成动合子的方法. 方法经黄尿酸刺激体外诱导感染鼠血中的约氏疟原虫雌雄配子形成、受精,采用梯度离心法分离得到纯净的合子,并在MEM培养基中培养. 结果从10～15只感染小鼠血液可分离到106数量级的约氏疟原虫合子;在22℃条件下,经22 h～24 h培养有动合子形成. 结论可以直接从感染鼠血诱导形成并分离到约氏疟原虫合子,所得合子经培养可发育为动合子.
-
疟疾疫苗研究概况
目前疟疾仍是严重危害人类健康的热带传染病,据WHO近5年的统计,每年平均约有2.1亿人发病,100多万人死于疟疾,世界上有100多个国家有疟疾流行,这些国家中一半的人口生活在疟区,热带非洲国家的人群疟疾发病率均呈上升趋势.而疟原虫抗药性及蚊媒耐药性的产生和迅速扩散,给疟疾的控制带来了更大的难度,似乎我们已经不可能指望采取单一的措施便能降服一种由生活史复杂、抗原高度变异的疟原虫引起的传染病.疟疾疫苗的研制和运用可为疟疾的综合治理提供有力的武器,但对疟原虫免疫机制的肤浅认识及缺乏适当的动物模型,使得有效的临床疟疾疫苗在经历半个世纪后的今天仍是凤毛鳞角.不过随着分子生物学技术的提高和分子免疫学研究的深入,疟疾疫苗已步入核酸疫苗时代,约氏疟原虫核酸疫苗的问世及显示对68%小鼠具有保护作用的结果[1],极大地鼓舞了疟疾疫苗的研究者.本文依据疟疾疫苗的发展,简介几种重要的疟疾候选疫苗及其作用机理,并简述对影响疟疾疫苗效果的相关因素.
-
大肠埃希菌中疟原虫MSP1-17编码基因蛋白重组及表达
目的 为免疫原性及疟疾特异性早期诊断研究,以及高效抗红内期疟原虫复合多价基因疫苗的研究提供基础.方法 (1)以鼠约氏疟原虫MSP1编码基因为模板,片段自4855到5271共416 bp,扩增出pyMSP1 DNA片段,将该片段克隆入质粒pPGEX-2T,构建含有GST编码的质粒pGEX-2T-PyMSP1-17.(2)用上述构建的质粒植入大肠埃希菌DH-5α表达重组蛋白.结果 (1)构建出约氏疟原虫裂殖子表面蛋白1融合基因片段真核重组表达质粒.(2)获得MSP1-GST融合蛋白,在大肠埃希菌DH-5α收获到重组的约氏疟原虫裂殖子表面蛋白浓度为46 mg/L.(3)原核表达的蛋白产物免疫小鼠后分离血清,采用间接免疫荧光法(IFA)检测疟原虫,滴度在1∶400～1∶1000之间均可识别IFA血片中的疟原虫.结论 设计重组MSP1-17基因在大肠埃希菌中真核系统内能够得到充分表达,并具有免疫原性和抗原性.无论是作为DNA疫苗研究的候选者抑或是制备特异性抗体进行疟疾早期诊断都具有重要的意义;由于该抗原的表达量高、免疫原性强,是目前很有希望的疟疾疫苗候选抗原之一.
-
约氏疟原虫动力素蛋白(PyDyn)的基因克隆及其结构域的免疫特性
目的分离、克隆约氏疟原虫动力素蛋白(Plasmodium yoelii dynamin-likeprotem,PyDyn)基因,并用其在原核表达的蛋白结构域产物做候选疫苗,研究其免疫保护性.方法应用约氏疟原虫基因组数据库,设计特异引物,用RT-PCR法从约氏疟原虫红内期mRNA扩增PyDyn基因编码区;分析其序列特性;原核表达约氏疟原虫动力素结构域蛋白、IFA分析其免疫原性.结果从鼠约氏疟原虫mRNA扩增的PyDyn基因编码区是一个全长为2 433bp的cDNA克隆,编码811个氨基酸的蛋白肽链,具有典型的动力素蛋白家族的结构特性.该基因GeneBank登录号为AF458071.IFA表明该虫源性结构蛋白(PyDyn)的第1、3、5结构域的抗血清可以识别约氏疟原虫感染的红细胞.结论经分离、克隆和表达的新PyDyn有望成为疟疾疫苗的候选抗原分子.
-
腹腔单核细胞对约氏疟原虫感染红细胞的免疫作用
目的检测腹腔单核细胞对约氏疟原虫感染红细胞(靶细胞)的免疫作用.方法用皂化约氏疟原虫感染的鬼形红细胞(SPRBC)腹腔注射免疫小鼠2次.3周后,用感染红细胞(PRBC)作为靶细胞注入腹腔,90 min后洗取腹腔细胞,用扫描电镜观察腹腔单核细胞的变化和对靶细胞的作用效应.结果腹腔细胞在靶细胞注入90 min后呈现各种激活状态:(1)腹腔单核细胞大小不均一,细胞表面绒毛变的细长浓密且有细胞间联接;(2)部分腹腔单核细胞胞浆摊展(呈"煎蛋"样)或呈"细胞炸弹"样;(3)延展或片状的绒毛和摊展的胞浆可粘附包卷靶细胞,并可使其因密集穿孔而受损.结论小鼠经约氏疟原虫感染的鬼形红细胞免疫后,其腹腔单核细胞对红内期疟原虫具有免疫保护作用.
-
双氢青蒿素哌喹对约氏疟原虫感染小鼠体内原虫消长的影响
目的:研究双氢青蒿素哌喹对约氏疟原虫感染小鼠红细胞感染率变化的影响.方法:用约氏疟原虫感染小鼠,于感染后第3天开始,连续3d口服双氢青蒿素哌喹20mg/kg,于感染后第2天开始每天观察其红细胞感染情况并计算感染率.结果:约氏疟原虫感染后,小鼠红细胞感染率逐渐上升.应用双氢青蒿素哌喹治疗后,红细胞感染率明显降低,与未治疗组相比差异显著(P＜0.05).结论:从原虫血症的变化上证明双氢青蒿素哌喹具有确切的抗疟效果.
-
外源性一氧化氮对约氏疟原虫配子体感染力影响的初步研究
目的探讨在约氏疟原虫感染早期,外源性NO对配子体感染力及红内期虫体血症水平的影响.方法以BALB/c小鼠及斯氏按蚊为实验对象,观察NOC5处理前、后感染小鼠虫体血症水平和蚊血食后其胃部囊合子形成状况.结果NOC5能够显著抑制配子体对蚊的感染力,而且其抑制作用与其剂量呈正比,但未发现对疟原虫红内期虫体的明显影响.结论外源性NO是介导约氏疟原虫配子体感染力下降的效应分子.
-
IFN-γ、TNF-α介导约氏疟原虫配子体感染力作用的探讨
目的确定约氏疟原虫感染早期配子体感染力与一些细胞因子的相关性.方法应用直接蚊吸血实验,观察了约氏疟原虫感染早期小鼠血液中配子体在蚊体内的发育情况,检测来自感染小鼠血清和蚊血食后其胃内血液中IFN-γ、TNF-α的含量,同时观察蚊血食8小时后胃内动合子的形成.结果在感染后第3天,小鼠血清中IFN-γ显著升高,而TNF-α未发现有意义的变化.蚊吸食这样的血液,其胃部囊合子形成效目却达到峰值.蚊胃内吸食的血液中两种细胞因子的含量和蚊体内动合子的形成与上述结果相一致.结论在约氏疟原虫感染早期发生的自然传播阻断过程中,IFN-γ不是直接灭活配子体感染力的效应分子.
-
一氧化氮对红内期约氏疟原虫感染的影响
目的:探讨约氏疟原虫感染早期一氧化氮(nitric oxide, NO)对红内期疟原虫的影响.方法:通过ELISA和Griess反应,观察疟原虫感染早期宿主体内细胞因子和NO对红内期虫体血症的影响及其效应.结果:疟原虫感染早期随着以IFN-γ分泌增加为主的Th1细胞免疫应答产生的过程,NO合成逐渐增加,红内期原虫血症受到抑制.一旦解除高水平NO的作用,虫体的增殖能力即可迅速得以恢复.结论:NO通过抑制裂殖子的侵袭力发挥抗红内期原虫感染的保护性免疫效应.
