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大劣按蚊血淋巴中疟原虫感染相关蛋白的cDNA克隆
疟疾是一种严重的传染病,大劣按蚊是我国及东南亚地区的重要传疟媒介.对大劣按蚊抗疟原虫感染分子机制的研究,具有重要意义.我们先前已成功分离了大劣按蚊血淋巴中约氏疟原虫感染相关蛋白(PIRP1),并对该蛋白进行了质谱检测.本研究在已获得PIRP1质谱检测信息的基础上,利用分子生物学技术,成功克隆了该相关蛋白的部分cDNA序列(CenBank序列号为EF409973).为下一步对该蛋白的功能研究奠定了基础.
关键词： 大劣按蚊 约氏疟原虫 克隆 约氏疟原虫感染相关蛋白PIRP1 血淋巴 -
海南省高疟区1990～1994年大劣按蚊监测
1990～1994年我们在海南省琼中黎族苗族自治县和平地区,对海南省山林地带和近山丘陵区的主要传疟媒介大劣按蚊成蚊进行了为期5年的监测.大劣按蚊为外栖性蚊种,在当地居民点内早出现时间为19:30,夜间活动高峰在22:00～23:00,室内外叮人比率为1∶2.79.山寮叮人率是村内叮人率的15倍,自然感染率可高达8.3%,雨季对大劣按蚊的孳生繁殖有极大的影响,溴氰菊酯浸帐村与对照村的大劣按蚊密度和经产蚊比率无显著性差异,在当地多种因素影响下,溴氰菊酯浸帐防制大劣按蚊的效果不理想.未对居民点邻近的山涧小溪及两岸边进行环境整治的开发,对大劣按蚊的密度和活动无影响.
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大劣按蚊前酚氧化酶基因部分序列的克隆与序列分析
目的克隆大劣按蚊(Anopheles dirus)前酚氧化酶(Prophenoloxidase,PPO)基因部分序列.方法根据已报道的多种昆虫PPO的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊总RNA为模板进行RT-PCR扩增,目的片段经TA克隆后测定其核酸序列,然后进行序列查询与比对.结果大劣按蚊PPO基因(AdPPO)部分序列长598 bp,编码199个氨基酸;AdPPO与冈比亚按蚊PPO5基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达84.23%和88.89%.结论成功克隆出AdPPO部分序列,其与冈比亚按蚊PPO基因序列具有很高同源性.
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按蚊中肠前酚氧化酶原与约氏疟原虫卵囊黑化的关系
目的分析约氏疟原虫卵囊黑化期间按蚊中肠内前酚氧化酶原(Prophenoloxidase,PPO)的变化,探讨中肠PPO与疟原虫卵囊黑化的关系. 方法解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后3、5、7、11和15 d斯氏与大劣按蚊中肠,匀浆后经SDS-PAGE和转膜,以抗烟草天蛾PPO的抗体进行免疫印迹分析,并于感染后第5 d开始在镜下观察约氏疟原虫卵囊黑化情况,直至第15 d止. 结果斯氏与大劣按蚊中肠在约氏疟原虫感染前和感染后的不同时期经免疫印迹均可检测到1条分子质量约为67 ku的PPO阳性蛋白带,但感染后的PPO蛋白带比感染前明显增强,而且同时间点大劣按蚊中肠PPO蛋白带比斯氏按蚊明显,尤其在感染的后期大劣按蚊中肠PPO蛋白带明显比斯氏按蚊增强;在感染后7 d可见大劣按蚊中肠内发育的约氏疟原虫卵囊部分黑化,在15 d时可见疟原虫卵囊完全黑化. 结论按蚊中肠PPO含量增加,尤其是长时间内维持在较高水平与约氏疟原虫卵囊黑化密切相关.
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大劣按蚊血淋巴中丝氨酸蛋白酶的分离与鉴定
目的 分离大劣按蚊血淋巴中的丝氨酸蛋白酶并进行鉴定. 方法 采集感染约氏疟原虫后24 h的大劣按蚊血淋巴,利用SDS-PAGE进行血淋巴蛋白的分离.然后,分别用烟草天蛾丝氨酸蛋白酶PAP1、PAP2和PAP3抗体进行 Western blot,检测血淋巴中相应的丝氨酸蛋白酶. 结果 SDS-PAGE分离出31条血淋巴蛋白带,分子质量单位为10～200 ku.Western blot结果显示,44 ku蛋白能被PAP1、PAP2和PAP3抗体识别,27 ku蛋白能被PAP1和PAP3抗体识别,38 ku蛋白能被PAP2抗体识别. 结论 成功分离和鉴定出了大劣按蚊血淋巴中的丝氨酸蛋白酶.
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大劣按蚊感染约氏疟原虫血淋巴相关蛋白的筛选和鉴定
目的 筛选并鉴定大劣按蚊感染约氏疟原虫后血淋巴的相关蛋白,为进一步的功能研究和蚊先天性免疫研究奠定基础.方法 以大劣按蚊- 约氏疟原虫为实验模型,利用二维电泳技术分离和比较饱吸约氏疟原虫感染的鼠血和正常鼠血后24 h 的大劣按蚊血淋巴蛋白,获得差异蛋白,并对差异蛋白进行N端氨基酸测序和生物信息学分析,从而推测差异蛋白的功能.结果 获得清晰二维电泳图,并筛选获得37个差异蛋白点.对其中比较明显的差异蛋白1进行氨基酸测序后发现,该蛋白可能为一翻译延伸因子.结论 成功分离和筛选获得了大劣按蚊感染约氏疟原虫血淋巴相关蛋白,并进行了初步鉴定.
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大劣按蚊在高温条件下的生长发育
目的:观察大劣按蚊(海南株)在高温条件下的生长、发育情况.方法:分为4个组,即25±1℃(对照组)、30±1℃、33±1℃、36±1℃,每组设3个样本.结果:33±1℃是蚊卵孵育的致死高温条件;温度升高一定程度后,幼虫发育成熟时间提前,化蛹期时限延长,蛹发育质量低下;36±1℃是成蚊的致死高温条件.在高温条件下,成蚊存活时限明显缩短,但对吸血活动影响不大,而饱血蚊产卵量明显减少,甚至几乎不能产卵.在33±1℃时,LT50平均为1天,仅为25±1℃时LT50的11.1%.结论:高温对不同发育期蚊虫均有较大的影响,甚至是致死条件之一.
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致倦库蚊及大劣按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性测定
目的 掌握海南省致倦库蚊和大劣按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性发生及发展趋势.方法 采用幼虫浸渍法,测定其对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性倍数.结果 五指山市、澄迈县和海口市的致倦库蚊对溴氰菊酯抗性倍数分别为7.50、6.67、8.00倍,对氟氯氰菊酯的抗性倍数分别为5.31、6.00、6.23倍;琼中县大劣按蚊对溴氰菊酯和氟氯氰菊酯的抗性倍数分别为1.12和1.31倍.结论 海南省致倦库蚊对这2种拟除虫菊酯类杀虫剂均产生了低抗药性;而大劣按蚊尚未产生.
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大劣按蚊含硫脂蛋白基因在约氏疟原虫感染中的作用
目的 分析大劣按蚊含硫脂蛋白(TEP1)基因在约氏疟原虫感染过程中的作用.方法 根据GenBank中大劣按蚊TEP1基因序列设计带有T7启动子的引物,以大劣按蚊cDNA为模板,进行PCR扩增,纯化产物,体外转录试剂盒合成AdTEP1双链RNA.羽化1～2日的雌性大劣按蚊分3组(200只/组):TEP1干扰组、绿色荧光蛋白(EGFP)干扰组和对照组.TEP1、EGFP干扰组按蚊分别进行胸部微量注射AdTEP1双链RNA、EGFP双链RNA各147 ng,对照组未处理.干扰后3 d,每组取15只按蚊,去头,以大劣按蚊核糖蛋白S7(AdS7)为内参进行半定量PCR,检测干扰效果.干扰后4 d,用约氏疟原虫BY256荧光株感染3组大劣按蚊.感染后9 d,每组各解剖25只蚊胃,记录感染率和感染度.结果 对照组和EGFP干扰组AdTEP1的表达条带亮度基本一致,而TEP1干扰组AdTEP1的表达条带亮度非常微弱.感染后9 d,蚊胃卵囊数统计学分析表明,对照组、EGFP干扰组和TEP1干扰组感染率分别为(24±2.83)%、(24±0.71)%和(80±3.54)%;感染度分别为0132±0.7、0.44±0.85和5.52±4.84,TEP1干扰组明显高于对照组和EGFP干扰组(P＜0.05).结论 AdTEP1干扰后明显增加了大劣按蚊的感染率和感染度,增强了大劣按蚊对约氏疟原虫易感性.
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青蒿琥酯阻断恶性疟传播的研究
目的 观察青蒿琥酯(ATS)对恶性疟原虫配子体的作用. 方法 31例外周血含恶性疟原虫无性体和配子体的志愿者分为ATS组(15例)、奎宁(QN)组(10例)和安慰剂组(6例).ATS组于第0、6和24 h口服青蒿琥酯片各200mg,第3～6天100 mg/d;QN组口服硫酸奎宁片,每天3次,500 mg/次,连服7 d;安慰剂组口服复合维生素B片,每天3次,2片/次,连服7d.每例患者每天检查外周血恶性疟原虫配子体密度,并于服药后第1、7、14、21和28天抽取静脉血人工感染大劣按蚊,检测其感染恶性疟原虫子孢子情况. 结果服药后ATS组恶性疟原虫配子体相对密度迅速下降,第7、14和21天分别为(12.5±3.3)%、(1.2±0.4)%和(0.3±0.1)%,转阴时间为(22.0±1.4)d;QN组第7、14和21天恶性疟原虫配子体相对密度分别为(173.9±47.0)%、(112.5±45.4)%和(32.5±17.8)%,转阴时间为(32.5+2.1)d,两组间转阴时间差异有统计学意义(t=4.731,P＜0.01);安慰剂组住院后恶性疟原虫配子体相对密度有所下降.患者血液人工感染大劣按蚊试验显示,服药第14天,A1S组、QN组和安慰剂组的子孢子阳性率分别为0、35.0%和48.7%.子孢子相对感染强度,ATS组第7和14天分别为18.2%和0;QN组第7、14和21天分别为142.0%、98.6%和20.3%.安慰剂组第1、7、14、21和28天子孢子感染强度较稳定,均为100%(6/6).结论口服ATS 6 d总量1000 mg对阻断恶性疟传播有良好的作用.
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核糖体蛋白S7在大劣按蚊抗疟原虫感染免疫研究中的内标作用
目的探讨核糖体蛋白S7(ribosomal protein,rpS7)在大劣按蚊抗约氏疟原虫感染免疫中的作用.方法根据rpS7的保守mRNA序列设计简并引物,以大劣按蚊血细胞mRNA为模板,进行RT-PCR扩增,克隆、并测定序列;RT-PCR结合凝胶图像扫描比较、分析血餐后d1、d2、d3、d4、d7和d11,未吸鼠血组(N)、吸正常鼠血组(B)和吸感染约氏疟原虫鼠血组(I)大劣按蚊血细胞中rpS7的转录差异.结果成功克隆大劣按蚊rpS7部分cDNA序列(465 bp),吸血和约氏疟原虫感染均未明显地影响大劣按蚊血细胞中rpS7的转录(P＞0.05).结论大劣按蚊血细胞rpS7可作为研究大劣按蚊抗约氏疟原虫感染免疫相关因子的内参照.
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一种延长大劣按蚊虫卵保存时间的方法
大劣按蚊(Anopheles dirus)是一种非滞育性昆虫,如饲料供应无缺,终年都可繁殖.虫卵在适宜条件下(温度为26℃±1℃,相对湿度60%～85%),胚胎发育较快,经3 d几乎全部发育成熟.
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海南垦区大劣按蚊和微小按蚊分布与疟疾发病的关系
海南农垦系统主要分布在山林地带，少数单位居住在丘陵及滨海平原地区，其疟疾发病情况各不相同。1991～1998年对垦区进行按蚊调查，并对不同按蚊分布区疟疾的发病情况进行系统观察。1 材料与方法1.1 按蚊调查 晚8～12 h，以人与牛诱捕成蚊，每小时捕蚊15 min，并带回鉴别蚊种。1.2 疟疾病例的发现 对“四热”病人采血涂片(厚、薄血膜各一)，染色后镜检疟原虫并鉴别虫种。
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套式PCR检测蚊体内疟原虫的研究
目的 建立一种敏感、特异而快速的检测蚊体内疟原虫的方法.方法 采用套式PCR方法,对人工感染间日疟原虫的嗜人按蚊、感染恶性疟和混合感染间日疟与恶性疟的大劣按蚊以及流行季节现场捕获的中华按蚊体内的疟原虫进行检测.结果 28批人工感染间日疟原虫的嗜人按蚊、2批人工感染恶性疟的大劣按蚊和1批混合感染间日疟与恶性疟的大劣按蚊的检测结果与镜检结果符合率为100%;589只现场捕获的中华按蚊中,发现间日疟原虫阳性2只,阳性率为0.34%.结论 本方法能快速而敏感地检出蚊体内不同种疟原虫.
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大劣按蚊丝氨酸蛋白酶cDNA克隆和表达
目的克隆、表达大劣按蚊丝氨酸蛋白酶.方法根据已报道昆虫的前酚氧化酶激活酶(prophenoloxidase-activating enzyme,PPAE)的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊血细胞mRNA为模板,进行RT-PCR扩增,克隆和测定插入片段;所得序列进行BLAST查询,并原核表达其中的两种PPAE样丝氨酸蛋白酶cDNA,通过SDS-PAGE和Western blotting 检测表达产物.结果和结论获得了3种大劣按蚊血细胞丝氨酸蛋白酶cDNA部分序列,即AdsP1(512bp),AdsP2(488bp)和 AdsP3(512bp).AdsP1和AdsP3与冈比亚按蚊sP14D1、sP14D2、3种昆虫 PPAE和黑腹果蝇Easter很相似,推测AdsP1和AdsP3可能是大劣按蚊的PPAE,起调节大劣按蚊黑化包裹约氏疟原虫反应的作用.另外,成功表达了AdsP1和AdsP3 部分cDNA序列.
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青蒿琥酯对食蟹猴疟原虫在按蚊体内发育的影响
目的观察青蒿琥酯(Artesunate)对食蟹猴疟原虫在大劣按蚊体内发育的影响.方法受疟原虫感染实验猴在肌注和静注青蒿琥酯各60mg之前、之后0h、2h各感染一批大劣按蚊;另取部分药前感染的大劣按蚊在感染后第3天和10.5天吸药血,另设一对照组吸正常猴血.各组实验蚊均在感染后第9天解剖蚊胃和第13天解剖涎腺,观察疟原虫在蚊体内发育情况.结果药前组和药后0h组的蚊胃及唾腺感染阳性率均为100%,两组蚊胃卵囊平均密度、卵囊平均大小、子孢子平均感染度都无显著性差异(P＞0.5);药前组和药后2h组蚊胃卵囊平均密度有显著性差异(P＜0.5);大劣按蚊感染后第3天和10.5天吸药血组和吸正常血组,蚊胃卵囊平均密度、卵囊大小、子孢子平均感染度都无显著性差异(P＞0.1,P＞0.5).结论青蒿琥酯对食蟹猴疟原虫在蚊体内的配子生殖、孢子增殖及子孢子进入唾腺无直接的抑制作用.
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与大劣按蚊先天免疫相关丝氨酸蛋白酶的克隆及分析
目的 克隆及分析与先天免疫相关的大劣按蚊差异基因.方法 利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)方法克隆大劣按蚊差异基因,并对与先天免疫相关的差异基因(文中命名为T6基因)进行生物信息学分析及半定量实验,分析约氏疟原虫感染前后其转录的变化,探讨它与按蚊抗疟原虫感染的先天免疫反应的关系.结果 目前克隆的差异基因包含以下几类:①与先天免疫相关的酶类;②与能量代谢有关的酶:③与信号传递和调节有关的因子.对与先天免疫相关的分子进行的半定量实验表明,大劣按蚊T6基因的转录与感染疟原虫相关.结论 本研究成功地克隆了与先天免疫相关的大劣按蚊差异基因,进一步的实验分析提示该基因可能与按蚊抗约氏疟原虫感染的黑化反应相关.
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大劣按蚊卵黄蛋白原cDNA的克隆及转录水平研究
目的 克隆大劣按蚊卵黄蛋白原cDNA,进行序列分析,并研究该基因在不同蚊期的转录水平变化.方法 首先提取大劣按蚊总RNA,反转录成cDNA;然后设计昆虫卵黄蛋白原简并引物,以该cDNA为模板进行PCR扩增和测序,对所获取的序列进行生物信息学分析;后利用实时荧光定量PCR方法检测卵黄蛋白原基因在蚊卵、幼虫、蛹和成蚊各时期的转录水平变化.结果 PCR成功扩增出了清晰的单一目的条带,经测序为一段1071 bp的序列,BLAST比对分析显示该序列与浅色按蚊、库态按蚊和斯氏按蚊的卵黄蛋白基因同源性高达90％,与冈比亚按蚊、微小按蚊和美彩按蚊的同源性达89％.对大劣按蚊各时期卵黄蛋白原转录水平的研究结果显示,4d龄按蚊卵黄蛋白原mRNA水平是3d龄按蚊的15.2倍,而吸血后卵黄蛋白原mRNA水平高效上调,是未吸血组的955.7倍(P＜0.01);吸血组6d龄按蚊卵黄蛋白原mRNA表达较吸血组4d龄按蚊骤降(下降近1 870倍),而与未吸血组6d龄按蚊相比,差异无统计学意义.结论 本研究成功地克隆了大劣按蚊卵黄蛋白原基因的cDNA;大劣按蚊血餐后24 h卵黄蛋白原基因高效表达,提示卵黄蛋白原基因可能参与了大劣按蚊蚊卵的发育.
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海南岛半个世纪抗疟的巨大成就和存在的技术问题
目的 评价海南岛半个世纪抗疟成就,为制定今后的抗疟措施提供参考和依据.方法 对已收集的有关资料和研究结果进行归纳、整理和分析,对半个世纪抗疟的成就提出初步评价.结果 通过全岛杀虫剂室内滞留喷洒消灭了主要传疟媒介家栖、嗜吸人血的微小按蚊,可能由于大规模的土地和森林开垦和生态环境的改变使重要媒介野栖的大劣按蚊的分布和危害范围明显缩小,以及疟区群众的居住条件和防蚊条件明显改善,导致了媒介能量或疟疾接受性和基本繁殖率稳定地、显著地降低,已从根本上改变了海南岛的疟疾传播条件,致使疟疾患病率(疟原虫率)和发病率稳固地下降,分别比抗疟前下降了97%和99%以上;大劣按蚊在少数山麓地区导致的上山感染以及兼吸人牛血并偏野栖微小按蚊的广泛存在是主要的存在问题.结论 海南岛半个世纪的抗疟已经取得了巨大的成就,基本上解除了疟疾的严重威胁,但疟疾还会持续存在,与疟疾的斗争还会是长期的.
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海南省2005-2014年大劣按蚊和微小按蚊的监测结果
目的 了解海南省疟疾流行区主要传疟媒介大劣按蚊和微小按蚊的种群密度和季节消长的发展变化趋势与疟疾发病的关系.方法 在海南省疟疾高度流行区选择山林区五指山市毛阳镇194山寮和琼中县和平镇贝湾村作为大劣按蚊监测点,丘陵区昌江县石碌镇牙营村作为微小按蚊监测点,对2种主要传疟媒介进行终年长期监测.大劣按蚊监测采用每月3次,每旬1次,每次从晚上8点至12点,由2～4人裸腿坐在屋檐下诱捕大劣按蚊,记录捕获的大劣按蚊数;微小按蚊监测采用每月3次,每旬1次,在傍晚落日时,在牛帐内拴一头水牛诱蚊,然后从晚上8点至12点,每小时由两人在牛帐内搜捕按蚊15min,第二天将捕获的按蚊进行分类鉴定,记录微小按蚊数.然后分别计算2种按蚊的种群密度,并结合当地疟疾发病资料进行统计分析.结果 194山寮监测点10年中大劣按蚊年密度高为1.17只/夜,低为0.33只/夜,维持一定的密度;贝湾村监测点10年中大劣按蚊年密度高为1.67只/夜,低为0.03只/夜,密度有逐年下降的趋势,已难捕到大劣按蚊;牙营村监测点10年中微小按蚊年密度高为5.56只/夜·帐,低为0.75只/夜·帐,维持在较稳定的水平.毛阳镇、和平镇和石碌镇疟疾发病分别从2009年、2010年和2005年起已没有当地感染病例出现.结论 海南省高疟区主要传疟媒介大按蚊和微小按蚊的种群数量已有较大幅度减少,且密度有逐渐降低的趋势,但也存在种群密度维持在较稳定水平的地区,疟疾发病为有媒介而无病人状态,疟疾已得到有效控制.
