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三重融合PCR法构建感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆
利用三重融合PCR法,即将3个DNA片段放在同一个反应里进行长片段PCR扩增法,融合得到了包含辛德毕斯病毒 XJ-160株结构基因E3、E2、6K、3′UTR和辛德毕斯病毒YN87448株结构基因E1的融合DNA片段E3E26KE13′UTR.通过此融合片段两端引入的Xba I和Xho I酶切位点将其连接到XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆骨架上,成功构建了辛德毕斯病毒株XJ-160与YN87448外膜糖蛋白基因E1相互替换的嵌合病毒cDNA克隆,命名为pBR-XJ160YE1.该克隆线性化后经体外转录,RNA转录体脂质体法转染BHK-21细胞,36h后细胞发生病变.间接免疫荧光检测到病毒蛋白的表达.提取5次传代后细胞上清中病毒RNA,RT-PCR法检测证明病毒来源于嵌合病毒cDNA克隆.此感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆可以作为研究辛德毕斯病毒E1糖蛋白基因相关功能及XJ-160病毒和YN87448病毒存在单方向血清学反应的分子机理的分子生物学工具.
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中国人白细胞介素-12 cDNA基因的克隆及序列分析与比较
为研究中国人IL-12的基因特征,采用逆转录巢式聚合酶链反应(RT-nPCR)从中国人脐带血单核细胞中分别克隆了P35、P40两亚基cDNA基因,包括完整的前体蛋白编码序列,其中P35 cDNA编码219个氨基酸的多肽,P40 cDNA编码328个氨基酸的多肽,与国外序列(NKSF、CLMF)比较结果发现:所克隆序列P35同NKSF相比,第44aa密码子由GTC(Val)→GTG(Val),但未改变氨基酸组成;同CLMF相比,244aa GAC(Asp)→GAT(Asp),247aa由ACG(Thr)→ATG(Met);P40亚基与CLMF的核苷酸、氨基酸组成完全相同,但与NKSF相比存在多处差异,239aa AAC(Asn)→AAG(Lys),291aa ACC(Thr)→ACG(Thr);3株序列的变异全部集中在相同的几个碱基位置.说明IL-12 cDNA基因尽管非常保守,但在核苷酸及氨基酸也存在一定的差异,其基因可能存在多态性,所克隆的IL-12基因具有一定的独特性.
关键词： 白细胞介素12(IL-12) cDNA克隆 序列分析 -
人干燥综合征A抗原克隆表达与重组蛋白及其临床应用研究
克隆人干燥综合征A抗原基因(SSA-60kD),为SSA抗原的表达和使用重组抗原建立ELISA法用于自身抗体的临床检测.根据GenBank中检索到的人SSA-60kD cDNA序列,在5'和3'非编码区设计特异性引物,提取人源HeLa细胞总RNA作为模板,经RT-PCR扩增SSA-60kD抗原cDNA.PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导人大肠杆菌DH5,构建重组质粒PET-30a-sSA-60kD.对后者进行酶切鉴定、测序和分析.在大肠杆菌中表达,产生重组融合蛋白.RT-PCR扩增产物为1632bp.PET-30a-SSA-60kD经EcoR I和V双酶切证实含目的基因片段.序列分析提示与GenBank中一致.利用金属螯合亲和层析法和纯化,得到了高纯度的SSA-60kD重组蛋白.成功克隆人SSA-60kD基因,并构建PE-30a-ssA-60kD,建立了ELISA方法,检测了风湿病患者血清中抗SSA-60kD自身抗体.
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一个人类α-甘露糖苷酶全长cDNA的分子克隆
用我们以往克隆到的1358bp 6A8 cDNA片段作探针,籍southern blot从一个人扁桃体细胞λgt11 cDNA文库筛选,再用RACE方法,克隆到了一个长3300bp的6A8全长cDNA.此cDNA内有一长3188bp(57～3245bp)的开放阅读框架,编码1064个氨基酸的蛋白质.此蛋白质的氨基酸序列与大鼠一个ER-α-甘露糖苷酶(1040个氨基酸)的相同性和相似性高达78%和82%,与一个酵母-α-甘露糖苷酶(1083个氨基酸)的相同性和相似性亦达33%和47%.另外,值得注意的是其260～432位氨基酸序列与人类、猪、大鼠和小鼠的多种α-甘露糖苷酶的相应氨基酸序列的相同性均高于20%,提示这段保守序列与α-甘露糖苷酶的功能可能有关.
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人神经系统特异表达RNA结合蛋白HuC cDNA的克隆、表达及纯化
目的克隆人神经系统表达RNA结合蛋白HuC的cDNA并原核表达纯化.方法提取人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株总RNA,经RT-PCR扩增得到人HuC全长cDNA的克隆.将HuC cDNA克隆到原核表达载体pGEX4T-3载体中,并转化到大肠杆菌中,在获得高效表达后,利用GST纯化系统,对HuC重组蛋白进行纯化.结果经过表达及纯化条件的摸索,终获得重组HuC蛋白.结论HuC蛋白是一种神经系统表达RNA结合蛋白,重组HuC蛋白的获得为HuC抗体的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.
关键词： RNA结合蛋白HuC cDNA克隆 原核表达 纯化 -
一个新的阴道毛滴虫Ras同源cDNA克隆的分离及其特征分析
Ras超家族是由一群具有保守氨基酸基序的GTP结合蛋白组成,作为双向分子开关对细胞的多种功能具有调节重要的作用.本文报告分离得到一个新的阴道毛滴虫Ras cDNA克隆,命名为RvRaxC.TvRasC cDNA编码一个194氨基酸的蛋白,与其它Ras亚家族成员蛋白序列的一致性在46%到52%之间.序列分析表明,该蛋白序列拥有Ras亚家族保守的结合GTP结构域.进化树分析发现该基因与人类的Rit基因位于同一亚群.由于Rit家族成员不含有CAAX异戊烯化基序,而TvRasC在羧基末端有一个典型的CAAX异戊烯化基序,因此TvRasC不属于Rit家族成员.在TvRasC的效应结构域内,与位于HRas第33位的天冬氨酸对应的氨基酸残基是天冬酰胺,有研究表明这种变化将大大削弱Ras基因家族与下游效应分子Raf的结合能力.因此我们预测TvRasC可能只有低水平的GTP酶活性,这种替换有可能使Raf失去与Ras结合域相互作用,并可能导致有活性有丝分裂蛋白激酶没有刺激效应.有关TvRasC在寄生性阴道毛滴虫原虫中的作用有待进一步研究.
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大鼠大脑组织中谷氨酸脱羧酶GAD67基因的克隆和序列测定
目的克隆大鼠脑组织中谷氨酸脱羧酶GAD67基因.方法采用RT-PCR方法,大鼠脑组织中的mRNA逆转录成cDNA,再以cDNA为模板,扩增谷氨酸脱羧酶GAD67基因片段,克隆入T载体,并经序列测定.结果 RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度1795bp相符,T载体克隆测序与大鼠谷氨酸脱羧酶GAD67 100%同源.结论采用RT-PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织中的谷氨酸脱羧酶GAD67基因克隆,为该基因的体外表达打下基础.
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人干细胞生长因子cDNA克隆、表达和纯化及其造血种属特异性
人干细胞生长因子(human stem ceil growthfactor,hSCGF)是一种早期造血调控因子.已知人干细胞生长因子具有两种形式,包括全长分子hSCGF以及在Ca2+依赖糖识别结构域(caldum-dependent carbohydraterecognition domain,CRD)内缺失78氨基酸的截短型分子hSCGFβ.hSCGFβ的造血刺激活性具有严格的种属特异性.本研究目的在于探讨hSCGF能否协同刺激小鼠粒/单系祖细胞增殖.为克服hSCGF的cDNA GC含量较高的困难,本研究以两步PCR的方法从人胎肝cDNA文库(Clontech)中成功克隆hSCGF cDNA,进而将hSCGF成熟肽编码序列亚克隆于原核表达载体pGEX4T-2中,融合表达.研究结果表明,通过低温诱导(28℃),重组表达产物主要以可溶蛋白的形式存在于裂解上清中,利用亲和层析纯化融合表达蛋白.对重组蛋白的造血刺激活性分析表明,不同于截短型分子hSCGFβ,全长分子hSCGF能够刺激小鼠骨髓粒/单系造血祖细胞增殖.结论:hSCGFCRD不直接结合受体,可能具有其他生物学功能.
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基于狂犬病病毒载体的基因工程疫苗研究进展
对HIV-1和HCV等重大传染性疾病传统疫苗研制的失败,让科学家们把目光转向开发新型疫苗研制策略.其中之一就是用减毒的重组病毒载体表达外源抗原来免疫,可以保护个体免受相应病原体的暴露威胁.一种新的手段就是从cDNA克隆拯救单股负链RNA病毒,这一技术为弹状病毒科成员用于疫苗载体和生物医学工具打开了一扇窗.
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登革2型病毒全长cDNA克隆定点诱变的OL-PCR方法
目的对带有登革2型病毒(DEN-2)全长cDNA的质粒pDVWS501上E62、E203位点进行定点诱变. 方法设计4对点诱变引物,运用OL-PCR(overlap PCR)法,扩增出分别在E62或E203位带有点突变的2条DNA片段,克隆至T载体,获T-TB62、T-TB203两个克隆.将T-TB62用ClaⅠ和SphⅠ分别酶切,T-TB203用SphⅠ+NheⅠ酶切后,用T4连接酶分别连接至pDVWS501,获重组质粒TB62和TB203.对TB62和TB203进行序列测定. 结果成功得到分别在E62、E203位带有点突变的TB62、TB203克隆. 结论 OL-PCR法是具有较高突变效率的定点诱变方法.
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NGAL基因cDNA的克隆及其表达载体的构建
目的:克隆NGAL基因的cDNA,并构建其表达载体.方法:应用RT-PCR技术,从食管癌细胞系SHEEC中扩增出NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因的cDNA,并重组到中间载体pT-Adv中,经测序和与NCBI数据库比较证实是NGAL基因的全编序列.然后把它分别插入到真核表达载体pcDNA 3和原核表达载体pGEX-4T-3中.结果:获得了NGAL基因的cDNA全序列,构建了NGAL的正、反向真核表达载体pcDNA-NGAL(+/-)和原核表达载体pGEX-NGAL,并在大肠埃希菌TOP10F＇中成功地表达出NGAL融合蛋白.结论:为研究NGAL基因的新功能和制备其抗体,进而阐明NGAL在食管癌等肿瘤中的生物学作用提供了有利工具.
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编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA克隆及序列分析
目的:获得编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA序列.方法:针对编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从雌性成年牛蛙肝脏中,扩增出编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白的基因序列,并将其克隆入载体pUCm-T中,通过酶切及序列测定鉴定重组载体.结果:经序列测定证实,重组载体含有正确编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA序列.结论:获得的阳性克隆含有374 bp的重组片段,为进一步深入研究其生物学活性及其抗肿瘤功能奠定了基础.
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人血小板生成素在大肠杆菌中的高效表达
目的:人血小板生成素(TPO)在大肠杆菌中的高效表达.方法:利用PCR技术,扩增出了(1～174个氨基酸的)人血小板生成素cDNA,并将其克隆到pGEX-1λT 载体中,构建了融合蛋白表达质粒.重组子用限制性内切酶酶切鉴定,表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE).结果:限制性内切酶酶切鉴定表明重组子含有正确的(1～174氨基酸)TPO cDNA片段;表达产物经SDS-PAGE相对分子质量约为43 000,与预期的相符合,表达占可溶性菌体总蛋白的44.56%.结论:表达产物具有明显的刺激Mo7e细胞增殖与CFU-Meg生成的功能.
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我国SARS病毒BJ01株基因组亚cDNA克隆的构建与鉴定
目的:构建我国SARS病毒BJ01株基因组全序列的亚cDNA克隆,为进一步构建该毒株的全长感染性cDNA克隆奠定基础.方法:根据BJ01株病毒基因组序列中含有的特异酶切位点,利用DNAstar软件设计7对引物,然后通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的7个cDNA片段,并分别将其克隆至pGEM-T Easy或Topo载体.结果与结论:已构建出SARS-CoV BJ01株基因组的7个亚cDNA克隆,经酶切鉴定和序列测定表明,所获得的cDNA克隆为BJ01株病毒的特异序列.
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SARS冠状病毒BJ01株基因组全长cDNA的构建与鉴定
目的:构建我国自行分离的SARS冠状病毒BJ01株基因组全长cDNA分子,为阐明SARS病毒致病的分子机制奠定基础.方法:采用分段克隆的方法对病毒全基因组进行分段扩增和克隆,然后将全基因组各cDNA片段分别进行体外连接获得全长cDNA分子,并对其接头序列进行PCR扩增和测序鉴定.结果与结论:获得了SARS病毒BJ01株基因组全长cDNA分子,对其接头处序列的测定结果表明,该全长cDNA分子为SARS病毒BJ01株的特异序列.
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小鼠骨髓组织4种造血生长因子受体cDNA片段的克隆和序列测定
目的:探索大剂量照射后造血生长因子受体基因的表达规律.方法:应用逆转录PCR技术,从小鼠骨髓造血组织中扩增出造血生长因子受体的目的片段,PCR产物与克隆载体连接后转化感受态大肠杆菌,阳性菌落提取质粒后进行序列测定.结果:4种造血生长因子受体片段均扩增成功,PCR产物经测序证实.结论:粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)、促红细胞生成素受体(EPOR)、促血小板生成素受体(c-mpl)和干细胞因子受体(c-kit) cDNA片段的克隆成功,为从整体水平上研究照射后造血生长因子受体的表达规律打下了基础.
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细菌感染大鼠血中血小板型磷脂酶A2 mRNA水平的变化及其cDNA克隆
目的观察感染大鼠血中血小板型PLA2 mRNA水平的变化,研究其基因和氨基酸顺序结构的特征.为开发新的抗菌药物提供依据.方法用半定量RT-PCR方法检测感染大鼠血中PLA2 mRNA,并对PLA2 cDNA进行克隆和序列分析.结果大鼠感染细菌后,血中血小板型PLA2 mRNA水平迅速明显增加,其DNA和氨基酸结构与其他组织来源的PLA2有高度的同源性.结论细菌感染可引起大鼠血中PLA2在基因水平上的迅速反应,这可使血小板型PLA2的生成增加并控制感染.血中克隆出来的PLA2 cDNA与大鼠其他组织来源的PLA2虽略有不同,但其酶的催化中心及基本结构完全一致.
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人干燥综合征A抗原重组体的构建及鉴定
目的 克隆人干燥综合征A抗原基因(SSA-52kD),为SSA抗原的表达和使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础.方法 根据GenBank中检索到的人SSA-52kD cDNA序列,在5'非编码区和3'非编码区设计特异性引物,提取人源Hela细胞总RNA作为模板,反转录RT-PCR扩增人干燥综合征SSA-52kD抗原cDNA.PCR产物纯化后连接至载体PET30a,导人大肠杆菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSA-52kD.对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序;对DNA测序结果进行鉴定分析.结果 RT-PCR扩增产物为1447bp.重组质粒PET-30a-SSA-52kD经Bgl Ⅱ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段.序列分析提示与GenBank中检索到的一致.结论 成功克隆人SSA-52kD基因,并构建重组质粒PET-30a-SSA-52kD.
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人血管生成素cDNA克隆及其在组织细胞中表达分布研究
血管生成素是一种具有明显促血管新生的蛋白因子,属于有特殊生物学功能的RNA酶家族.我们从人外周血白细胞中克隆了血管生成素cDNA,进行了DNA序列对比分析.同时对其在不同组织和细胞系中的表达情况进行了检测,并首次利用RT-PCR法在KG-1、Jurkat、HepG2、Tf-1、HL60、HEL和神经胶质细胞中检出血管生成素mRNA,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.
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小鼠红细胞分化相关因子cDNA片段的克隆与分析
目的克隆与小鼠红细胞终末分化相关因子的基因,并对其表达特性进行分析.方法用致贫血Friend病毒(FVA)诱导BALB/c小鼠脾脏产生大量FVA原红细胞,后者经分离纯化并在促红细胞生成素作用下进行体外培养.采用减除杂交与PCR相结合的方法,用未经培养的FVA诱导的原红细胞(0 h FVA原红细胞)的cDNA对培养36 h的FVA诱导的成红细胞(36 h FVA成红细胞)的cDNA进行多次减除杂交和PCR扩增,构建上述36 h cDNA的质粒减除文库并进行差异筛选.对阳性克隆进行核苷酸序列测定及Northern印迹分析.结果获得1个472 bp的cDNA片段,其中含有1个309 bp的开放阅读框架,编码102个氨基酸.经GenBank进行同源比较,未发现同源序列,已被GenBank接受,(编号AA¨4369).Northern印迹分析表明,该cDNA在培养36 h的FVA中、晚幼红细胞中呈差异表达,其mRNA全长约为500～600bp左右.将其暂命名为小鼠红细胞分化相关因子(MEDRF)基因.结论 MEDRF基因在红细胞分化的中、晚幼阶段特异表达,表明MEDRF是一个新的与红细胞终末分化相关的因子.
