首页 > 文献资料
-
动物SARS-CoV样病毒研究进展
与人SARS冠状病毒(SARS-CoV)高度同源的动物SARS-CoV样病毒存在较广泛,动物SARS-CoV样病毒的进化与对人体的致病性密切相关.
关键词： SARS-CoV SARS-CoV样病毒 变异 -
SARS冠状病毒未知蛋白Orf 9b的克隆、表达和结构分析
从SARS病毒基因组中克隆Orf 9b基因并构建pET32-Orf 9b原核表达质粒,在原核细胞中表达目的重组蛋白并将其纯化.经肠激酶酶切后,得到分子量为11 kD的0rf 9b蛋白.ELISA检测表明重组Orf 9b蛋白可以与SARS康复病人血清反应而不与健康人血清反应.用圆二色光谱和红外光谱初步分析了重组Orf 9b蛋白的二级结构组成.圆二色光谱显示重组Of 9b蛋白中α-螺旋占12.5%,β-折叠占40%,无规则卷曲占47.5%,红外光谱显示重组Orf 9b蛋白中α-螺旋占13.7%,β-折叠占47.5%,无规则卷曲占37.9%,两种检测方法对重组Orf 9b蛋白结构分析的结果基本一致,提示Orf 9b蛋白富含β折叠,而α-螺旋含量较少.获得该重组蛋白及对其结构的初步分析为进一步研究Orf 9b蛋白的功能奠定基础.
-
SARS-CoV核蛋白和宿主细胞相互作用的初步研究
寻找与SARS-CoV核蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,从而探索SARS-CoV的致病机理.可溶性表达SARS-CoV核蛋白,利用His标签和离子交换层析对表达的蛋白进行了纯化,获得较纯的可溶性核蛋白.再将SPR/BIA技术与MALDI-TOF MS技术结合起来,使用SPR生物传感芯片作为亲和吸附的表面,分别捕获2BS细胞和A549细胞裂解液中与SARS-CoV核蛋白相互作用的细胞蛋白,收集足够量的相互作用蛋白,再利用MALDI-TOF-MS分析获得蛋白的性质.结果鉴定出与SARS-CoV核蛋白相互作用的蛋白:26S蛋白酶调节亚单位S10B(蛋白酶体亚单位p42)(蛋白酶体26S亚单位ATPase 6)(P62333),属于泛素/蛋白酶体系统;目前国内外尚未见类似报道.此研究初步发现了一种与SARS-CoV核蛋白在细胞外相互作用的蛋白,但这种相互作用在SARS-CoV感染及SARS的发生发展中发挥的作用还有待于深入研究和探索.
-
SARS-CoV N蛋白与人冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-229E的交叉反应表位及特异表位的确定
为确定SARS-CoV N蛋白的特异抗原表位,对3种人冠状病毒SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白之间的交叉免疫反应进行了系统研究.构建了分别表达SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白的重组痘苗病毒,并制备了相应的小鼠免疫血清.用间接免疫荧光方法,检测了3种N蛋白的表达及其与3种冠状病毒免疫动物血清和SARS病人恢复期血清之间的反应.与此同时,用Western blot方法分析了原核表达的39个不同区段的SARS-CoV N蛋白与3种冠状病毒动物免疫血清和SARS病人恢复期血清之间的交叉反应性.免疫荧光检测结果表明,SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E3种病毒的N蛋白在重组痘苗病毒感染的HeLa细胞中均可以特异表达;3种N蛋白之间存在明显交叉免疫反应.Western blot结果显示,SARS-CoV N蛋白的表位主要位于30～60aa、170～184aa、301～320aa和360～422aa;与HCoV-OC43的交叉反应表位主要位于30～60aa、90～120aa、204～214aa和320～360aa;与HCoV-229E的交叉反应表位主要位于30～60aa、150～160aa和301～360aa.含SARS-CoV N蛋白特异表位的重组肽N155b(60～214aa)和N185(30～214aa)只与SARS病人恢复期血清和灭活SARS-CoV免疫小鼠的血清反应,而不与灭活HCoV-OC43和HCoV-229E免疫的山羊血清产生交叉反应.上述结果为使用SARS-CoV N蛋白抗原进行特异诊断试剂的研究,提供了重要的实验依据.
-
SARS病毒受体ACE2的克隆、原核表达及其功能区鉴定
ACE2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)是SARS冠状病毒(severe acute respiratory syndrome associated coronavirus, SARS-CoV)的主要受体.此研究旨在鉴定ACE2的SARS-CoV受体功能区,为进一步阐明SARS-CoV与细胞间的相互作用机制及研制抗病毒药物等提供理论依据.利用RT-PCR从Vero-E6细胞的mRNA中分两段扩增ACE2基因,其中N端片段ACE2A1-367(102～1 210nt)不包括ACE2的酶活性位点(1 223～1 237nt, 或374～378aa),而C端片段ACE2B335-805(1 101～2 524nt)包括ACE2的酶活性位点.扩增片段克隆入pMD-18T,并进行测序鉴定.进一步构建与GST基因融合表达的原核表达质粒pGEX-ACE2A与pGEX-ACE2B,IPTG诱导表达.表达的融合蛋白分子量为65kD和77kD,主要以包涵体形式存在.Western blot证实表达产物具有免疫学活性.将纯化的包涵体蛋白质复性后进行Western blot分析,证实pGEX-ACE2A表达的蛋白(～65kD)能与SARS-CoV S1蛋白特异结合,而pGEX- ACE2B表达的蛋白(～77kD)不能与S1蛋白结合.结果表明,ACE2的受体活性与酶活性位点无关,受体功能区在ACE2 N端367个氨基酸内.
-
SARS病毒快速检测膜研制
建立一种快速检测严重急性呼吸综合症冠状病毒(SARS-CoV)的方法.从SARS冠状病毒刺突蛋白基因中扩增出羧基端片段,克隆并表达.用经Ni-NTA树脂纯化的表达蛋白作为抗原包被硝酸纤维素膜,捕获感染SARS病人血清中的抗体.抗原抗体通过渗滤在膜上反应,5min肉眼即可观察到结果.通过比较不同试剂用量条件下的结果确定检测抗原的佳浓度.通过本产品检测已经过ELISA验证的50份血清样品证明两种检测结果无显著性差异(P＞0.05).与ELISA相比,该检测方法特异性、灵敏性几乎相当,但具有简单、快速、成本低廉等ELISA所无法比拟的优点,适合于初步诊断和流行病学调查.
-
SARS-CoV假病毒中和试验技术的建立及评价
为避免传统的SARS病毒中和试验需要操作活毒而存在的生物安全隐患,建立了基于假病毒系统、操作较安全的SARS中和试验技术平台.本研究应用高效表达SARS-CoV S(密码子优化的全长S蛋白,简称S)的真核表达载体(pVRC8304),与HIV慢病毒包装质粒(p CMV△8.2)及转移质粒(pHR'CMV EGFP)3个质粒载体系统共同转染人胚肾细胞293T,包装了SARS假病毒;通过SARS假病毒感染的RD-A细胞中标记基因EGFP表达的分析,确定SARS假病毒能有效进入细胞,建立了可在BSL-2级实验室操作的SARS病毒中和试验技术平台.用该技术平台对不同免疫血清进行了中和抗体分析,并比较了基于假病毒和基于SARS活病毒的中和试验效果.结果显示:SARS假病毒和SARS活病毒两个中和试验系统获得中和抗体滴度变化趋势一致,表明本研究构建的SARS假病毒可替代SARS活病毒用于建立操作上安全的SARS病毒中和试验技术平台.
-
靶向SARS-CoV spike中和抗体的检测
目的 建立靶向SARS-CoV spike中和抗体的检测模型.方法 构建优化的全基因SARS-CoV spike质粒免疫小鼠产生S1190抗血清,与合成的结合受体ACE2的S318-510蛋白进行作用,通过荧光显微镜观察对SARS假病毒感染抑制作用的变化以确证中和抗体的高效性.结果 SARS-CoV spike质粒诱导产生的S蛋白全长抗血清不但可以有效中和SARS假病毒进入HEK293E/ACE2-Myc细胞,S318-510蛋白的预处理可以降低抗血清对SARS假病毒的进入抑制效应.结论 受体结合部(RBD)的S318-510蛋白靶向SARS-CoV spike中和抗体的检测模型得到有效的验证.可以作为直观迅速判断中和抗体是否高效的模型推广至不具备P3级别的实验室.
-
人冠状病毒229E、OC43与SARS-CoV血清学相关性的研究
目的 检测正常人和SARS患者血清中3种人冠状病毒(229E、OC43和SARS-CoV)特异性抗体,分析3种冠状病毒血清学相关性.方法 采用免疫印迹、免疫荧光和ELISA方法检测100例健康献血员、34例SARS患者恢复期以及11例SARS患者双份血清中229E、OC43和SARS-CoV 3种冠状病毒核衣壳(N)蛋白抗体.结果 用免疫荧光方法检测100例健康献血员血清中229E、OC43和SARS-CoV IgG阳性率分别为98%、100%和1%,34例SARS患者恢复期血清中3种冠状病毒IgG的阳性率均为100%;免疫印迹检测100例健康献血员血清中229E、OC43和SARS-CoV N蛋白IgG阳性率分别97%、99%和2%,34例SARS患者恢复期血清中229E、OC43和SARS-CoV N蛋白IgG阳性率分别97%、100%和100%;11例SARS患者的急性期和恢复期双份血清中,免疫荧光检测有5例出现229EIgG滴度4倍或以上升高,10例出现OC43 IgG滴度4倍或以上升高,ELISA检测2例出现229E N蛋白IgG滴度4倍以上升高,没有一例出现OC43 N蛋白抗体滴度升高.结论 正常人群中普遍存在229E和OC43两种人冠状病毒抗体,SARS-CoV感染者存在对人冠状病毒229E和OC43血清学交叉反应,提示核衣壳蛋白不是引起血清学交叉反应的主要抗原,结果对研究SARS溯源有重要意义.
-
治疗用马抗SARS-CoV免疫球蛋白体外抗SARS-CoV的研究
目的研究3个批号的治疗用马抗SARS-CoV免疫球蛋白在体外对SARS-CoV的抑制作用. 方法确定SARS-CoV BJ-01株毒力后,采用MTT法确定药物对Vero-E6细胞的毒性.将一定量的SARS-CoV BJ-01株病毒液加入培养好的Vero-E6细胞中,置37℃,5% CO2孵箱中培养不同时间后加入以大无毒浓度开始的不同浓度的药物继续培养,采用MTT法检测药物对病毒的抑制作用. 结果 3个批号的治疗用马抗SARS-CoV免疫球蛋白不同时间点的治疗指数(TI):2 h组>6 h组>12 h组>24 h组;200307批>200306批>200308批. 结论治疗用马抗SARS-CoV免疫球蛋白在体外均有抗SARS-CoV作用,其中200307批的抗病毒效果好,为其用于SARS治疗提供了实验依据.
-
我国SARS病毒BJ01株基因组亚cDNA克隆的构建与鉴定
目的:构建我国SARS病毒BJ01株基因组全序列的亚cDNA克隆,为进一步构建该毒株的全长感染性cDNA克隆奠定基础.方法:根据BJ01株病毒基因组序列中含有的特异酶切位点,利用DNAstar软件设计7对引物,然后通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的7个cDNA片段,并分别将其克隆至pGEM-T Easy或Topo载体.结果与结论:已构建出SARS-CoV BJ01株基因组的7个亚cDNA克隆,经酶切鉴定和序列测定表明,所获得的cDNA克隆为BJ01株病毒的特异序列.
-
抗SARS冠状病毒药物细胞筛选模型的建立及应用
目的:建立抗SARS冠状病毒(SARS-CoV)药物细胞筛选模型,应用于抗SARS-CoV药物的筛选,为SARS的防治奠定基础.方法:将一定数量的细胞接种96孔板,根据药物的作用机制采用不同的给药途径,以观察到的细胞病变(cytopathic effect,CPE)为指标,按照Reed-Muench法,计算药物的细胞半数中毒浓度 (TD50)和抑制细胞半数病变的有效浓度( IC50).结果与结论:Vero-E6细胞接种SARS-CoV后24 h即可出现CPE,且CPE明显,便于观察,可作为抗SARS病毒药物细胞筛选模型.依此模型筛选了3类87种药物,确认6种药物在Vero-E6细胞上具有抑制SARS病毒的作用.该模型的建立也为其他的抗病毒药物的筛选提供了技术平台.
-
密码子优化和蛋白加强免疫对SARS-CoV N基因重组质粒免疫原性的影响
目的:观察密码子优化的SARS-CoV N基因的重组质粒,以及DNA初始免疫-蛋白加强免疫方式诱导小鼠的体液免疫应答水平,探讨提高SARS-CoV DNA免疫原性的途径.方法:SARS-CoV BJ01株N基因和密码子优化N基因分别通过从病毒RNA中RT-PCR扩增和人工合成获得,并克隆至pVAX1载体.将重组质粒DNA以100 μg/只的剂量肌肉注射免疫BALB/c小鼠,于第20天同剂量再免疫1次后,于第40天再用50 μg/只剂量的N蛋白加强免疫.每次免疫后于第10天采集血清,用ELISA检测血清中抗SARS-CoV N蛋白特异性抗体效价.同时设单纯重组质粒DNA免疫组和重组N蛋白免疫组作为对照.结果:密码子优化的N基因的重组质粒DNA免疫可诱导小鼠产生高水平体液免疫应答;而采用DNA初始免疫-N蛋白加强免疫的方式则可使抗体效价提高至少10倍.结论:密码子优化和DNA初始免疫-蛋白加强免疫这两种途径均可提高SARS-CoV N基因重组质粒DNA在小鼠中的体液免疫应答水平.
-
SARS-CoV细胞受体的研究进展
严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)是由SARS冠状病毒(SARS coronavirus,SARS-CoV)感染引起的一种新发严重急性呼吸系统传染病.SARS-CoV受体的阐明对于了解病毒的宿主与组织嗜性具有重要意义,同时也有助于了解病毒的致病机制以及研发阻止病毒结合受体的抗病毒药物.目前的研究发现SARS-CoV的受体包括血管紧张素转换酶2(ACE2)和CD209L,二者在SARS-CoV的感染致病过程中均发挥重要作用.本文综述了在SARS-CoV细胞受体结构与功能方面的研究进展.
-
阿比多尔抗SARS病毒的体外实验研究
目的观察抗流感病毒药物阿比多尔(arbidole)体外抗SARS-CoV作用.方法以利巴韦林作为阳性对照药,采用MTT法和细胞病变(CPE)法,观察阿比多尔对SARS-CoV的抑制作用.结果 MTT法测得阿比多尔对细胞的大无毒浓度为10μg*ml-1,对SARS-CoV的IC50为7.14μg*ml-1,治疗指数TI为1.77.阳性对照药利巴韦林的IC50为66.1μg*ml-1,治疗指数TI>6.1.结论阿比多尔在体外对SARS-CoV有抑制作用.
-
α-干扰素和γ-干扰素以及联合作用体外抗SARS-CoV试验研究
目的 体外评价α-干扰素和γ-干扰素是否对SARS-CoV有抑制作用,以及α-干扰素和γ-干扰素以5种不同比例配伍后,对SAHS-CoV的抑制作用.方法 采用MTT法,观察α-干扰素和γ-干扰素对SARS-CoV的抑制作用.结果 病毒TCID50为10-7;α-干扰素和γ-干扰素在体外有抗SARS-COV活性,α-干扰素的抗SARS-CoV活性作用大于γ-干扰素,配伍后抗SARS-CoV活性作用大于单个药物.结论 α-干扰素和γ-干扰素及配伍后均在体外有抗SARS-CoV作用,这为其治疗SARS-CoV感染提供了实验依据.
-
重组SARS-CoV未知功能小蛋白X5表达、纯化及抗体制备
将SARS-CoV未知功能小蛋白X5的基因在大肠杆菌中进行诱导表达,获得以包涵体形式存在的重组X5蛋白.通过高浓度尿素变性溶解包涵体,亲和层析法纯化蛋白,然后对其进行尿素梯度透析复性,终得到的蛋白纯度＞95%,终产率93.3 mg·L-1.SDS-PAGE电泳和LC-ESI-MS/MS结果表明,该重组蛋白大小与理论相符,序列与GenBank中注册的X5蛋白序列一致,说明该蛋白为目的蛋白.利用纯化的X5蛋白制备得到多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1:72 900,说明纯化后的蛋白对兔有很强的免疫原性.X5多克隆抗体的成功制备,为将来鉴定X5蛋白的药理学活性奠定了基础.
-
抗SARS病毒的药物及疫苗设计研究进展
目的介绍抗SARS病毒的药物及疫苗设计策略.方法综述近期国内外相关文献.结果这些策略主要包括阻断病毒与宿主细胞脂膜融合,阻止病毒颗粒复制等,以及与此相关的抑制剂、多肽等药物的设计以及灭活病毒疫苗、DNA疫苗、重组载体疫苗等的设计策略.结论它们将为人类终攻克SARS病毒发挥重要的作用.
-
不同试剂盒检测SARS-CoV抗体的方法学评价
目的:通过对ELISA方法和蛋白芯片法测定SARS-CoV抗体的方法学比较,探讨不同SARS试剂盒在辅助诊断非典型肺炎的临床应用价值.方法:同时用两种ELISA试剂盒检测 135 名SARS康复患者及 500 名健康献血者的SARS-CoV抗体,并随机选取 48 例小汤山医院确诊SARS康复期患者血清采用蛋白芯片法进行SARS多抗原蛋白测定.结果:重复性实验,两种ELISA试剂盒的批内变异系数分别为6.06%、10.5%;批间变异系数分别为6.57%、11.3%.相关性实验结果显示两试剂盒有良好的相关性(R2=0.9 456),且无显著性差异(P>0.05).48 例 SARS 康复患者血清用 ELISA 方法测定 34 例为阳性, 用蛋白芯片法 35 例阳性, 阳性率分别为 70.83%、 70.83%、 72.9%.结论:ELISA方法具有较好的重复性,两ELISA试剂盒之间有很好的相关;相比之下,蛋白芯片法灵敏度较高,优于ELISA方法.
-
SARS-CoV感染康复者血清对豚鼠肺、脾脏功能的影响
目的:为了探讨SARS-CoV感染患者急性病理损伤的免疫反应机制.方法:应用SARS-CoV感染康复者血清 24 h 内多次注射豚鼠体内,观察肺脏损伤及血液气体变化.结果:动物在第 3 次注射康复者血清后出现急性严重呼吸困难,血氧明显降低、二氧化碳明显升高,肺组织病理显示肺组织大量炎细胞浸润,脾组织白髓淋巴细胞减少,而用正常人血清注射动物后未出现类似变化.结论:给豚鼠多次注射SARS-CoV感染康复者血清可导致急性肺损伤.
