应用飞行时间质谱仪快速鉴定细菌的初步研究

目的 研究基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对细菌快速鉴定的影响因素.方法 应用8种细菌,比较了不同培养基(哥伦比亚血琼脂、伊红美兰琼脂、普通营养琼脂)及培养时间对细菌质谱图的影响.结果 不同的培养基及培养时间会对细菌质谱图产生影响.结论 选择合适的培养基及培养时间可以提高细菌检测的准确率.

枝孢芽枝菌主要过敏原的分析与免疫、质谱鉴定

目的 分析并用免疫和质谱方法鉴定枝孢芽枝菌(Cladosporium cladosporioides)的主要过敏原.方法 空气中暴皿获得枝孢芽枝菌菌种,经鉴定后大规模培养;用碳酸盐缓冲液提取枝孢芽枝菌蛋白,并用SDS-PAGE、Western-blotting方法鏊定出枝孢芽枝菌的主要过敏原.主要过敏原胶内酶切,再经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,所得质谱数据进入网站(http://www.matrixscience.com)Mascot检索比对.结果 经过暴皿获得枝孢芽枝菌菌种,其蛋白粗提液SDS-PAGE结果显示有14个条带,含量丰富的有10个条带;Western-Blotting鉴定出18kD的蛋白阳性率达66%,为枝孢芽枝菌的主要过敏原;质谱显示枝孢芽枝菌主要过敏原与约18kD嗜冷杆菌(Psychrobaaer arcticum)50S的核糖体蛋白的匹配分值高.结论 采用免疫、质谱法鏊定了枝孢芽枝菌的主要过敏原是约18kD的核糖体蛋白.

MALDI-TOF-MS技术在血液系统疾病中的应用进展

蛋白质是人类执行生命活动的直接载体，对于蛋白质的深入研究，不但有助于全面阐释生命活动的本质，而且对于研究疾病发生机制、提前预警以及诊断疾病、疗效的预后预测均具有重要意义。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术是目前蛋白质组学研究中经常用到的质谱研究技术之一，已经广泛应用于临床研究。现就其在血液系统疾病中的应用进展进行总结。

利用蛋白质组学技术筛选不同中医证型的寻常型银屑病血浆的相关蛋白

目的:研究不同中医证型寻常型银屑病患者血浆的差异表达蛋白,筛选不同中医证型寻常型银屑病患者血浆的特异性蛋白质标记物.方法:收集寻常型银屑病30例(其中血热证、血瘀证、血燥证各10例)、健康人10名的外周血浆,应用双向电泳/基质辅助激光解析电离飞行时间质谱联用技术(MALDI-TOF-MS)技术,检测血浆的蛋白峰值.结果:寻常型银屑病组与健康对照组间差异蛋白点为2个,差异蛋白峰为4 964.42和6 630.68;血热证患者与血瘀证患者之间差异蛋白点为1个,差异蛋白峰为2 661.29,血热证患者与血燥证患者之间差异蛋白点为2个,差异蛋白峰为6 432.69和6 630.87,血瘀证患者与血燥证患者之间差异蛋白点为4个,差异蛋白峰为3 241.60、1 945.18、6 631.49和4 418.77.结论:寻常型银屑病组和健康对照组以及银屑病不同中医证型间血浆蛋白表达谱存在差异,可能与银屑病的发病机制以及各证型的微观物质基础有关.

利用磁珠法结合MALDI-TOF MS进行慢性心衰气阴虚证血液蛋白质组学研究的方法学探讨

目的:建立磁珠法结合MALDI-TOF MS进行慢性心衰气阴虚证血液蛋白质组学研究的实验方法.方法:采用MALDI-TOF-MS技术检测不同磁珠分离的患者血液蛋白质谱,从采集、蛋白提取、反复冻融、重复性、基质样品比例等方面分析其影响.结果:血清质谱峰均多于血浆,弱阳离磁珠出峰数量优于铜整合磁珠,气阴虚证患者与健康组比较蛋白表达有明显差异.结论:该方法作为一种高通量、快速分离、制备和鉴定的蛋白质组学技术,整个实验体系稳定、可靠、重复性好,适用于中医证候蛋白质组学的研究.

水蛭抗凝血活性成分的研究

目的:研究水蛭的抗凝血成分.方法:以血浆复钙时间为指标,应用Sephadex DEAE A-50阴离子交换树脂色谱、Sephadex G-25和Sephadex LH-20凝胶过滤色谱及反相高压液相色谱技术分离纯化.结果:得到3个抗凝血活性多肽,其中化合物1,2在自然条件下互相转化,它们的相对分子质量分别为7 100和5 531;采用HPLC及SDS-PAGE鉴定了化合物3的纯度,采用MALDI-TOF-MS法测定出其相对分子质量为8 608,并测定了其氨基酸组成.结论:推测化合物3为首次分离得到的抗凝血多肽,命名为蚂蟥多肽(whitmanin).

梅花鹿骨提取物中2个新多肽的分离与鉴定

利用C4300(A),Sephadex G-50和半制备HPLC等色谱技术对鹿瓜多肽注射液组方成分梅花鹿骨提取物的多肽类化学成分进行研究,分离纯化得到2个多肽类化合物,其精确相对分子质量分别为m/z1 489.868 5和m/z2 113.870 6.通过MALDI-TOF-MS及ExplorerTM软件从头测序(De Novo测序)分析,鉴定了2个多肽类化合物的N端(氮端)一级序列,分别为NH2-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Se-Gly-Pro-Asp(梅花鹿骨18肽,1)和NH2-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Pro-Asp-Ser-Try-Asp(梅花鹿骨23肽,2).1和2均为新多肽.

中药饮片耐热菌微生物类群的分析

探索污染中药饮片的耐热菌微生物组成和多样性特征.以9个品种中药饮片为研究对象,采用MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱技术和Illumina Miseq的16S rRNA宏基因组高通量测序技术对样品的耐热菌微生物群落进行分析.茎类饮片(鸡血藤、通草、小通草)的污染菌检出率高,种类多;而果实类饮片(南五味子)检出率低,污染菌种类少;根类饮片中,广山药和熟地黄的污染菌检出率和种类偏低.耐热菌微生物类群以芽胞杆菌科和类芽孢杆菌科为主;其中检出率高的菌属为芽孢杆菌属,还包括短小芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、土壤芽胞杆菌属,高通量测序注释的其他菌属为肠杆菌属、短波单胞菌属、明串珠菌属、甲基杆菌属、脱氯单胞菌、泛菌属、克雷伯菌属和欧文氏菌属等.中药饮片的耐热菌微生物群落潜在危害因子,应完善其微生物限度标准,严格控制产品中的致病菌,加强中药饮片在生产和流通环节的监督管理.

蜈蚣胃蛋白酶解物体外抗凝活性肽类的分离与分析

目的:采用凝胶过滤色谱和C18反相色谱对蜈蚣胃蛋白酶解物的抗凝活性部位进行分离纯化,并检测其相对分子质量分布范围.方法:按色带及280 nm紫外光谱法收集凝胶色谱分离各流分；以活化部位凝血活酶时间(APTT)为指标,检测各流分体外抗凝活性；用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测其相对分子质量分布范围.结果:经凝胶过滤色谱和C18反相色谱纯化得到了抗凝活性组分,用MALDI-TOF-MS测得其相对分子质量分布范围为597～1 146.结论:凝胶过滤色谱和C18反相色谱可用于蜈蚣胃蛋白酶解物抗凝活性组分的分离纯化,其抗凝活性组分为小分子肽类.

SARS-CoV核蛋白和宿主细胞相互作用的初步研究

寻找与SARS-CoV核蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,从而探索SARS-CoV的致病机理.可溶性表达SARS-CoV核蛋白,利用His标签和离子交换层析对表达的蛋白进行了纯化,获得较纯的可溶性核蛋白.再将SPR/BIA技术与MALDI-TOF MS技术结合起来,使用SPR生物传感芯片作为亲和吸附的表面,分别捕获2BS细胞和A549细胞裂解液中与SARS-CoV核蛋白相互作用的细胞蛋白,收集足够量的相互作用蛋白,再利用MALDI-TOF-MS分析获得蛋白的性质.结果鉴定出与SARS-CoV核蛋白相互作用的蛋白:26S蛋白酶调节亚单位S10B(蛋白酶体亚单位p42)(蛋白酶体26S亚单位ATPase 6)(P62333),属于泛素/蛋白酶体系统;目前国内外尚未见类似报道.此研究初步发现了一种与SARS-CoV核蛋白在细胞外相互作用的蛋白,但这种相互作用在SARS-CoV感染及SARS的发生发展中发挥的作用还有待于深入研究和探索.

Objective To develop a matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) approach to identify Staphylococcus aureus (S. aureus) and differentiate methicillin-resistant S. aureus (MRSA) from methicillin-sensitive S. aureus (MSSA). Methods A total of 100 S. aureus strains isolated from clinical specimens and farm workers were collected and analyzed by MALDI-TOF-MS. And data obtained were interpreted with biotyper software. Results Ninety-two strains were identified by MALDI-TOF-MS as S. aureus at a level of secure genus and probable species, and 4 strains were identified at probable genus after their cultivation, spectral collection and data preprocessing. One strain was identified as S. aureus with lower score. It was revealed that identification of S. aureus by MALDI-TOF-MS was highly correlated with typing by biochemical and serological methods with an accuracy as high as 97%. The biotyper cluster analysis showed that 100 isolates were divided into 2 types at the distance level of 400. Higher peak intensity in the mass of both 3784 Da and 5700 Da was observed in MRSA, whereas that was absent from MSSA. Conclusion MALDI-TOF-MS is considered as a simple, rapid and highly reproducible technique with high-throughput and accuracy for the identification of S. aureus and it can reliably differentiate MRSA from MSSA.

MALDI-TOF-MS在HBV相关肝癌蛋白质组学中的应用价值

目的 探究基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)在HBV相关肝癌蛋白质组学中的应用价值.方法 选取2018年1月-2018年6月在我院就诊的HBV相关肝癌患者30例,健康自愿者25例,弱阳离子磁珠捕获技术血清蛋白,运用MALDI-TOF-MS技术以及相关软件进行蛋白质分析,检测HBV相关肝癌的血清标志蛋白质,建立肝癌诊断模型,进行盲法验证.结果 共筛选出81个蛋白质峰,而具有统计学差异的有27个(P＜0.05),其中17个差异蛋白呈现高表达上调,10个差异蛋白呈现低表达下调.经BPS5.0软件筛选出3个差异蛋白峰(质荷比M/Z为9179.55、7789.00、4097.00)建模,后经盲法验证,其敏感性90.91％,特异性为77.78％.结论 MALDI-TOF-MS技术为HBV相关肝癌的诊断和治疗提供了重要的依据.

MALDI-TOF-MS鉴定宋内志贺菌的初步应用研究

目的 通过扩充基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)的数据库研究宋内志贺菌的鉴定.方法 用提取法进行宋内志贺菌质谱图的建库,建库后分别使用直接涂抹法和提取法对50株宋内志贺菌野生株进行鉴定.结果 提取法的鉴定符合率为100％,而直接涂抹法的鉴定符合率为60％.结论 MALDI-TOF-MS通过数据库的扩充和流程的优化可以鉴定宋内志贺菌到血清学水平,它将会成为临床微生物实验室的诊断和鉴别工具.

温度对粘质沙雷菌蛋白质表达谱的影响

目的:研究粘质沙雷菌在不同温度下蛋白表达谱的差异,为探讨温度对生理特性和代谢产物的影响奠定基础.方法:采用双向电泳技术对25℃/37℃培养的粘质沙雷菌蛋白表达谱进行了比较和分析,差异蛋白点经过胶内酶切后进行MALDI-TOF质谱鉴定,所得到的肽指纹图谱用Mascot进行检索.结果与结论:共鉴定到31个差异点对应于23种蛋白.其中,S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表达在37℃下调,给出了有关灵菌红素生物合成的新证据;此外,研究还发现,鲱精胺酶在37℃表达上调,提示粘质沙雷菌精氨酸代谢可能会随温度发生改变.

同一个体多种体液用于筛选卵巢癌早期诊断标志物的研究

目的 采用蛋白质组学方法在卵巢癌患者的多种体液中同时筛选出共同异常的多肽,用于卵巢癌早期诊断的研究,并在卵巢癌患者的血清中进行验证,加深对卵巢癌癌变机制的理解.方法 采用WCX磁珠结合MALDI - TOF - MS技术在卵巢癌患者的血清、腹水、尿液、囊液中进行比对筛选,将筛选出的异常改变的多肽峰在训练集和验证集血清中检验其诊断卵巢癌的灵敏度与特异度.结果 四种体液中筛选出来卵巢癌患者血清中下调和上调的多肽峰分别为6081 Da和4466DaP＜0.05),经留一法验证,诊断卵巢癌的特异度为100％,敏感度为100％,盲法检测的诊断特异度为100％,敏感度为87.5％.结论 同一个体的四种体液中同时筛选得到的肿瘤标志物具有较高的特异性,对卵巢癌的早期诊断具有一定价值.

胶原诱导性关节炎大鼠滑膜双向凝胶电泳图谱建立及差异分析

目的:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一个多基因多因素参与的病理过程.实验中通过建立与RA发病机制相似的胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠动物模型,运用蛋白质组技术对正常大鼠和CIA大鼠模型不同时间点滑膜组织的蛋白质点进行比较分析,为鉴定CIA大鼠滑膜病变相关蛋白质及研究RA发病机制奠定基础.方法:用牛Ⅱ型胶原和完全福氏佐剂建立CIA大鼠模型,采用一步抽提法抽提滑膜蛋白质,运用固相pH梯度双向凝胶电泳分离各组大鼠滑膜组织的总蛋白质,用PDquest软件分析图谱,比较差异蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)得到相应肽质指纹图谱,用Mascot查询软件搜索数据库,鉴定部分差异蛋白质.结果:成功建立了CIA大鼠模型,获得分辨率较高、重复性较好的大鼠滑膜组织双向电泳凝胶图谱.正常组与25、35和45天模型组大鼠滑膜组织凝胶图谱的平均蛋白质点数分别为1 070±41、1 049±22、1 079±44和1 088±39.在4个组均有表达差异的蛋白质点中随机取20个点进行肽质指纹图分析,鉴定了部分与细胞代谢、信号转导及结构相关的差异表达蛋白质.结论:建立了分辨率较高且重复性较好的正常大鼠与CIA大鼠不同时间点滑膜组织的双向凝胶电泳图谱,鉴定了一些与CIA大鼠滑膜病变相关的差异表达蛋白质,为识别RA病变相关蛋白质及推断RA病变过程奠定基础.

血清多肽图技术在急性白血病微小残留病监测中的应用

微小残留病(Minimal residual disease ,MRD)是急性白血病(acute leukemia,AL)复发的根源.目前尚缺乏一种无创、省时、灵敏度和特异性较高的血清学评价方法.我们利用磁珠分离和MALDI-TOF-MS检测的血清多肽图分析技术,对AL及健康者进行血清多肽的分析,观察AL特异性多肽在初发及治疗后缓解患者的血清样本中的变化趋势,探讨血清多肽图技术在AL MRD监测中的作用.

应用尿液蛋白质组技术筛选多发性骨髓瘤相关蛋白的初步研究

目的 应用蛋白质组学相关技术筛选多发性骨髓瘤(MM)患者尿液中差异表达的蛋白质,寻找与MM诊断相关的疾病标志物.方法 收集MM组、疾病对照组(肾脏疾病)、健康对照组尿液各8例,TCA沉淀法提取尿液蛋白质后建立双向凝胶电泳图谱;Image Master软件筛选差异蛋白质;利用MALDI-TOF-MS获得肽质量指纹图谱,通过Mascot软件进行数据库搜索,得到蛋白质鉴定结果.结果 筛选出57个差异蛋白点,43个在MM组上调,14个下调.对其中30个差异蛋白点进行分析,鉴定出甘露聚糖结合凝集素相关蛋白19(Map19)、人组织相容性抗原A2(Hla-A2)、视黄醇结合蛋白(RBP)、转甲状腺素蛋白(TTR)、免疫球蛋白轻链、α2-糖蛋白1(ZAG1)等9类差异表达的蛋白质.结论 应用尿液蛋白质组技术成功筛选鉴定出MM尿液中存在的差异蛋白质,可能是MM疾病诊断相关标志物,尚需要进一步验证.

怀化侗族高血压人群IL-1 Ra、CK-18、α-烯醇化酶蛋白质表达差异

目的：分析怀化侗族高血压患者血淋巴细胞蛋白质谱，寻找高血压患者血淋巴细胞差异蛋白质。方法应用MALDI-TOF-MS技术检测130例血淋巴细胞标本（侗族高血压50例，汉族高血压40例，侗族正常人群40例）的蛋白质质谱，用MatrixScience公司的Mascot对蛋白质质谱数据进行数据库查询比对，并搜索鉴定蛋白。结果三组均获得重复性好的血淋巴细胞蛋白质双向凝胶电泳图谱。通过对其中3个差异表达蛋白点分析，并经质谱鉴定。与侗族正常人对照，侗族高血压人群α-烯醇化酶表达上调，CK-18表达差异无统计学意义（P﹥0.05），IL-1Ra表达下调；汉族高血压人群CK-18、α-烯醇化酶两个点表达上调，IL-1Ra表达下调。结论 IL-1Ra和α-烯醇化酶可作为预测高血压发生、发展程度的一个候选生物学标志物。

双向电泳联合MALDI-TOF-MS技术在筛选食管癌铂类耐药患者中的应用研究

目的:采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术检测食管癌(EC)患者化疗敏感性血清蛋白质谱,指导临床EC患者化疗方案的选择.方法:收集2013年1月至2014年6月我院收治的EC术后复发并行含铂化疗的患者40例,按照化疗疗效分为敏感组和耐药组.将两组蛋白质双向凝胶电泳图谱用ImageMaster 2D platinum 5.0软件分析并匹配,筛选出两组差异斑点,并采用MALDI-TOF-MS技术检测EC患者化疗敏感性血清蛋白质谱.结果:两组差异斑点共有68个,以耐药组为参照,敏感组患者血清蛋白下调的斑点有42个,上调的斑点有26个.从这68个差异斑点中筛选出8个斑点进行质谱鉴定,通过数据库检索分析和鉴定终确定上述斑点所对应的蛋白质名称分别为Kininogen-1,Alpha-2-HS-glycoprotein,Fibrinogen beta chain,Clusterin,Retinol-binding protein 4,Beta-2-glycoprotein l,Ig kappa chain C region,Complement C4-A.结论:基于铂类化疗的EC敏感患者和耐药患者间存在差异表达蛋白.