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枝孢芽枝菌主要过敏原的分析与免疫、质谱鉴定
目的 分析并用免疫和质谱方法鉴定枝孢芽枝菌(Cladosporium cladosporioides)的主要过敏原.方法 空气中暴皿获得枝孢芽枝菌菌种,经鉴定后大规模培养;用碳酸盐缓冲液提取枝孢芽枝菌蛋白,并用SDS-PAGE、Western-blotting方法鏊定出枝孢芽枝菌的主要过敏原.主要过敏原胶内酶切,再经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,所得质谱数据进入网站(http://www.matrixscience.com)Mascot检索比对.结果 经过暴皿获得枝孢芽枝菌菌种,其蛋白粗提液SDS-PAGE结果显示有14个条带,含量丰富的有10个条带;Western-Blotting鉴定出18kD的蛋白阳性率达66%,为枝孢芽枝菌的主要过敏原;质谱显示枝孢芽枝菌主要过敏原与约18kD嗜冷杆菌(Psychrobaaer arcticum)50S的核糖体蛋白的匹配分值高.结论 采用免疫、质谱法鏊定了枝孢芽枝菌的主要过敏原是约18kD的核糖体蛋白.
关键词： 枝孢芽枝菌 过敏原 MALDI-TOF-MS 核糖体蛋白 真菌 -
溃疡性结肠炎脾胃虚实证候核糖体蛋白基因表达研究
目的 研究健康人、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)脾虚证和湿热证患者核糖体蛋白(ribosomal protein,RP)基因表达差异情况,为从蛋白合成角度理解"脾为气血生化之源"提供实验依据.方法 制作RP基因芯片,对4名健康人、4例UC脾虚证和4例UC湿热证患者结肠黏膜进行检测,应用BRB-TOOL(3.9)软件包进行数据分析,对差异基因进行生物信息学分析.结果 成功制作了包括77条RP基因,2条RP类似基因(RPL26-like1、RPL7-like1)的低密度芯片.UC(脾虚证+湿热证)患者与健康人之间有12条差异基因,全部为下调基因;湿热证与健康人之间有19条差异基因,全部呈下调趋势;脾虚证与健康人有3条差异表达基因,全部为下调基因;脾虚证与湿热证有6条差异表达基因,全部为上调基因.聚类分析显示健康人与UC患者样品可以根据本芯片的基因表达谱进行分类,湿热证和脾虚证可以通过聚类分开.多个差异基因有共同转录调节因子.结论 成功制作了RP基因芯片,UC脾虚证和湿热证RP基因表达下调;健康人、UC脾虚证和UC湿热证都有各自相应的RP基因表达谱.
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核糖体蛋白基因表达与肿瘤的关系
核糖体蛋白是组成核糖体的主要成分,在细胞内蛋白质生物合成中发挥重要作用.近来人们发现,核糖体具有参与DNA修复、细胞发育调控和细胞分化等核糖体外功能.并且在胃癌、结直肠癌、食管癌和肝癌等肿瘤组织中一些核糖体蛋白基因高表达,通过对肿瘤组织中核糖体蛋白基因高表达的深入研究,可以进一步阐明肿瘤发生、发展的机制,了解核糖体蛋白基因高表达在恶性肿瘤中的作用,为肿瘤的基因诊断和基因治疗开辟一个新的研究领域.
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核糖体蛋白异常与相关血液疾病
核糖体蛋白(ribosomal protein,RP)是组成核糖体的重要元件之一,它普遍存在于每一个细胞中并且含量丰富,可以和RNA结合形成核糖体行使蛋白质合成的功能.除了参与蛋白质的生物合成之外,RP还具有独立于核糖体之外的功能,包括参与DNA的修复,调控细胞增殖、凋亡和分化,称之为RP的核糖体外功能(extraribosomal functions).目前,已经证实部分血液系统的疾病与核糖体蛋白异常有关.由于骨髓造血细胞的快速更新,生长,分化过程中需要大量核糖体蛋白参与蛋白质的生物合成及细胞生长的调控,因而血液系统更容易受到核糖体蛋白表达异常的影响.本文就核糖体蛋白异常与相关血液疾病问题作一综述.
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核糖体蛋白RPL36A siRNA对U937细胞的促增殖、抑凋亡作用
本研究探讨RPL36A基因在急性髓系白血病(AML)病人的表达情况及可能的作用机制.应用RT.PCR检测急性髓系白血病细胞、正常人单个核细胞、U937细胞中RPL36A基因的表达情况;RPL36A siRNA经脂质体介导转入U937细胞,采用MTT法及DNA倍体分析检测细胞增殖.AO/EB、TUNEL、Annexin V/FITV检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blot检测RPL36A基因及蛋白表达水平的变化.结果表明:RPL36A在初治AML细胞和U937细胞中表达明显增高;MTT法及DNA倍体分析发现,U937细胞增殖受到抑制.细胞周期阻滞;AO/EB染色、TUNEL、Annexin V/FTTV检测显示,转染RPL36A siRNA的细胞组凋亡率高于对照组;RPL36A siRNA作用可引起U937细胞的RPL36A的mRNA水平的降低和蛋白表达量的下降,且呈时间依赖性(r分别为0.9813和0.9537).结论:AML细胞高表达RPL36A基因,RPL36A基因的高表达可能促进AML细胞的过度增殖并抑制其凋亡.
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幽门螺杆菌抗菌肽对消化道致病菌的杀伤作用
幽门螺杆菌(Hp)可产生杀菌肽样抗菌多肽(cecropin-like antibacterial peptide,Hp-CABP).这种来源于Hp核糖体蛋白L1(ribosomalprotein L1, rpL1)的N-端肽,在结构与功能的许多方面与杀菌肽(Cecropins)相似.我们通过研究Hp源杀菌肽样抗菌肽Hp(2-20)对消化道常见致病菌的杀伤作用,探讨Hp产生抗菌肽的临床及流行病学意义.
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核糖体蛋白L5在胃癌中的表达及功能
目的:探讨核糖体蛋白L5(ribosomal protein L5,RPL5)在胃癌细胞中的表达及对胃癌细胞生长的影响.方法:Western blot检测RPL5在胃癌细胞系中的表达,构建RPL5特异性siRNA载体,转染细胞,Western blot进行鉴定,MTT方法和流式细胞术检测转染细胞的生长变化.结果:RPL5在胃癌细胞系AGS、MKN45、SGC7901、MGC803中的表达均明显强于在GES-1和正常胃黏膜上皮中的表达.成功构建RPL5特异性siRNA载体U6RPL5A和U6-RPL5B,转染AGS细胞,进行稳定筛选,发现U6-RPL5A能显著抑制RPL5的表达,其相应的细胞系AGS-U6-RPL5A的生长速度减慢.细胞周期检测结果显示AGS-U6-RPL5A细胞中处于增殖期的细胞减少了约5%.结论:对RPL5功能的进一步深入研究可能会有助于胃癌的诊断和治疗.
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酵母双杂交技术筛选白细胞中乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白结合蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV核心蛋白编码基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBV核心蛋白编码基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落17个,其中肿瘤高甲基化1基因3个,编码线粒体蛋白的DNA聚合酶γ基因1个,乙酰辅酶A合成酶3基因1个,假定翻译起始因子基因1个,趋化因子受体5基因1个,线粒体核糖体蛋白L41基因1个,Kyot结合蛋白基因1个,Ran结合蛋白基因1个,真核细胞翻译延伸因子2基因2个,未知基因5个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒核心蛋白的结合蛋白,为进一步研究HBV核心蛋白在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
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抗核抗体阳性的标本与其免疫球蛋白IgG含量的相关性
抗核抗体对自身免疫性疾病(AID),如系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、多发性肌炎(PM)、皮肌炎(DM)、系统性硬皮病等有重要的诊断价值,ANA的靶抗原为细胞核内的不同生化成分,包括核酸、细胞核蛋白和核糖体蛋白.ANA参与机体的发病机制,导致机体的免疫应答增强,造成机体免疫性病理损伤或功能障碍,本文探讨了80例ANA阳性的标本与其IgG含量的相关性,从而对AID的诊断、治疗及判断预后提供科学依据.1 对象与方法
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结核分支杆菌异烟肼和链霉素耐药基因的杂交检测
异烟肼(INH)、链霉素(SM)作为结核病治疗中主要的一线抗结核药物,对其耐药性的研究日益受到重视.传统的结核分支杆菌耐药性测定由于需要6-8周时间,不能及时指导临床用药.近年来,随着分子生物学技术的不断发展,对结核菌的耐药机制有了进一步认识,认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关,也inhA基因突变也有相关性[1].耐链霉素的产生是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL和16SrRNA的编码基因rrs的缺失和突变所导致[2].我们采用采用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术分别对肺结核病人痰标本临床分离株和结核病人痰标本直接进行KatG基因、inhA基因、rpsL基因、rrs基因的突变检测,现将结果报告如下.
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结核分支杆菌链霉素耐药性的杂交检测
我国是结核病疫情严重的国家之一,其主要原因是耐药(DR-TB)和耐多药(MDR-TB)结核病的广泛分布和迅速传播.MDR-TB的流行已成为20世纪全球结核病第3次回升的4大原因之一.因此,耐药问题已成为结核病防治工作中迫切需要解决的问题.链霉素(SM)作为主要的一线抗结核药物之一,对其耐药性的研究日益受到重视.国外也有报道[1]:认为结核分支杆菌耐链毒素的产生是由于其核糖体蛋白S12编码基因(rpsL)和16SrRNA编码基因(rrs)的突变所致.我们采用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术检测了47株肺结核病人临床分离株(其中药物敏感株13株,耐SM或含耐SM的耐多药株34株),并对21例结核病人痰标本直接进行rpsL基因、rrs基因突变分析,现将结果报告如下.
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十全大补汤对SV40T抗原转基因小鼠晶状体自发肿瘤的抑制作用及其分子机制
目的:探讨十全大补汤对SV40 T抗原转基因(TG)小鼠晶状体自发肿瘤的抑制作用,阐明其抑癌的分子机制.方法:SV40 T抗原TG小鼠随机分为对照组(n=39)和药物处理组(n=25),对照组小鼠正常喂食,药物处理组小鼠出生3周后开始喂食添加十全大补汤的饲料,记录每只小鼠生存时间.在喂食十全大补汤8周和15周时,随机抽取各组小鼠(n=3)尾静脉血,检测血清氨基酸水平.取血后小鼠麻醉致死并取出肝脏,利用基因芯片杂交检测小鼠肝脏组织中与核糖体功能相关的基因表达差异.结果:生存分析,与对照组比较,药物处理组TG小鼠生存率明显升高(P＜0.05).氨基酸检测,与对照组比较,喂食十全大补汤8周时,药物处理组TG小鼠血清中丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和羟赖氨酸水平升高(P＜0.05),胱硫醚、牛磺酸、甲基组氨酸、肌肽和乙醇胺水平降低(P＜0.05);15周时,与对照组比较,药物处理组TG小鼠血清中苏氨酸和瓜氨酸水平升高(P＜0.05),其他氨基酸水平无明显变化(P＞0.05).基因芯片杂交检测,与对照组比较,药物处理组TG小鼠肝组织表达的9 083个基因中与核糖体功能相关的13个基因发生改变(P＜0.05).结论:十全大补汤能改善TG小鼠血清氨基酸水平,增强肝脏核糖体蛋白合成,通过改善肝脏功能明显延长TG小鼠生存期.
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核糖体蛋白家族成员与 MDM 2-p53通路调控的研究进展
肿瘤是危害人类生命健康的主要的疾病之一。 p53是目前为止研究多的抑癌基因，p53的功能紊乱是肿瘤发生主要的原因。核糖体蛋白发挥核糖体外功能抑制鼠双微体基因2（ murine double minute 2， MDM 2）并激活 P 53是近十年的研究热点。本文就核糖体蛋白与 MDM 2-p 53通路调控关系及其与肿瘤治疗的研究进展进行综述。
关键词： MDM2-p53通路 核糖体蛋白 核糖体应激 肿瘤治疗 -
核糖体蛋白基因家族与肿瘤的关系
核糖体是蛋白质合成的场所,核糖体蛋白是核糖体的重要组成部分,所以核糖体蛋白异常,对细胞的生理活动会产生严重影响,引起多种疾病,甚至引起细胞的恶性转化,而导致肿瘤的发生.一些核糖体蛋白基因在多种肿瘤中表达异常,与肿瘤的发生、发展以及多药耐药(MDR)有关.
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核糖体蛋白基因在胃肠道肿瘤中的表达
目的 探讨核糖体蛋白(RP)基因在胃肠道肿瘤中的表达.方法 对NCBI网站中的基因表达系列分析(SAGE)数据库公布的80个癌和癌旁正常组织RP基因进行对比分析(包括结肠癌和胃癌)后,取胃癌、结肠癌标本各30例,通过逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)对RP L13(RPL13)、RPL37、RPS2和RPS19基因的表达进行检测.结果 SAGE数据库分析表明: RPL13、RPL37、RPS19、RPS2和RPLP2在胃癌中表达比正常胃组织中表达平均分别高6.25、2.40、3.86、2.22和3.15倍,在结肠癌中的表达比正常结肠组织中表达平均分别高(3.22)、7.10、2.55、5.87和2.84倍;RT-PCR结果 显示胃癌和结肠癌组织中RPL13、RPL37、RPS2和RPS19 mRNA的表达均高于正常组织(P<0.05).结论 胃肠道肿瘤中存在着共同高表达RP基因,这些共同高表达RP基因可能与消化道肿瘤的发生、发展密切相关.
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日本血吸虫核糖体蛋白SjRibosomal_L18a及其B细胞表位的筛选和评价
目的 筛选获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum)核糖体蛋白(SjRibosomal_L18a)编码基因,预测其B细胞表位.克隆、表达重组蛋白SjRibosomal_L18a,并比较分析其与合成的B细胞表位的潜在诊断价值. 方法 利用B细胞表位预测软件筛选日本血吸虫蛋白质序列,获取函数打分值较高且抗原表位片段多的免疫原性蛋白,合成B细胞表位片段.生物信息学方法分析免疫原性蛋白基因及其编码蛋白的相对分子质量(M3、等电点、亲水性、信号肽、跨膜区和功能结构域等理化性质.制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA,逆转录PCR (RT-PCR)扩增目的基因,分析各虫期转录本丰度.将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a中,重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)BI21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸标记亲和层析法纯化重组蛋白.ELISA法比较分析重组蛋白和合成的B细胞表位的潜在诊断价值. 结果 预测软件筛选出免疫原性核糖体蛋白SjRibosomal_L18a以及2个B细胞表位(P1和P2).SjRibosomal_L18a基因开放阅读框(ORF)由531个碱基组成,编码176个氨基酸,不含跨膜区和信号肽,为Mr20 741,等电点为11.12.RT-PCR结果显示,各虫期均检测到SjRibosomal_L18a的转录本,且转录水平均较高.成功构建重组表达质粒SjRibosomal_L18a/pET-28a,诱导表达获得包涵体形式的重组蛋白,约为Mr26 069.ELISA检测结果显示,重组蛋白、P1和P2检测15份慢性血吸虫病患者血清和15份健康人血清的敏感性和特异性分别为53.3％ (8/15)和100％ (15/15)、60％ (9/15)和100％ (15/15)、73.3％ (11/15)和100％ (15/15). 结论 获得重组蛋白SjRibosomal_L18a及其免疫原性较高的表位片段P1、P2,P1和P2用于血清诊断的敏感性均高于重组蛋白.
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抗多药耐药靶点及相关药物的研究进展
抗多药耐药是指在疾病的治疗过程中,细胞对多种药物产生广泛的耐受,导致治疗效果不理想的现象.多药耐药多发于感染与肿瘤疾病的治疗中,已成为治愈这2类疾病的主要障碍.从转运蛋白和离子通道、酶以及核糖体这3个方面综述抗多药耐药靶点的机制及相关药物的研究进展,旨在为抗多药耐药药物的研发提供参考.
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核糖体蛋白 L22表达沉默对细胞周期蛋白D1表达的影响
目的：研究核糖体蛋白L22（RPL22）基因表达沉默对细胞周期蛋白D1表达的影响。方法体外培养人肺动脉平滑肌细胞（PASMC），分为空白对照组（A组）、内皮素1（ET‐1）诱导组（B组）、siRNA‐RPL22转染组（C组）、siRNA‐RPL22＋ET‐1组（D组）、siRNA转染组（E组）和siRNA＋ET‐1组（F组）。采用RT‐PCR和Western blot分别检测RPL22、细胞周期蛋白D1的mRNA和蛋白表达，细胞计数试剂盒检测PASMC增殖情况。结果与A组和E组相比，C组RPL22、细胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白表达均降低，PASMC增殖减少（P＜0．05）。经ET‐1诱导后，D组细胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白表达较B组和F组降低（P＜0．05）。结论 RPL22表达沉默能有效抑制PASMC增殖，可能与下调细胞周期蛋白D1表达有关。
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RNA干扰技术干涉后核糖体蛋白S15a在胃癌中的表达及意义
目的：探讨RNA干扰（RNAi）技术干涉后核糖体蛋白S15a（RPS15a）在胃癌中的表达及意义。方法选取12例胃癌患者手术切除的胃癌组织，利用RNAi干涉RPS15a基因，将小片段克隆到质粒中，分别提取质粒后转染胃癌细胞BGC823。将未转染、随机小片段转染非编码序列、siRPS15a-1转染、siRPS15a-2转染的BGC823细胞分为BGC823- WT组、siNC组、siRPS15a-1组、siRPS15a-2组，RT- PCR法及Western blot分别检测各组RPS15a RNA及蛋白的表达情况，流式细胞仪检测细胞增殖的变化。结果 RNAi后细胞中出现了明显的绿色荧光，提示此转染方式是可行的。转染检测结果表明，本实验提取的RNA未受到质粒DNA的污染，可以进行表达的比较。siRPS15a-1组、siRPS15a-2组RNA及蛋白表达相对灰度比值与BGC- WT组、siNC组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），BGC- WT组与siNC组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。RNAi后细胞增殖速度显著下降，多数细胞集中在G0/G1期。结论 RNAi技术不仅可以下调RPS15a在胃癌中表达，而且还可以抑制胃癌细胞的增殖活性。
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吡柔比星通过抑制雷帕霉素信号通道的哺乳动物靶点引发人膀胱癌细胞自体吞噬反应
目前吡柔比星广泛用于膀胱灌注治疗膀胱癌,但是其疗效因耐药性会受到一定的影响,目前吡柔比星的作用机制还没得到完全的阐述。本研究通过吡柔比星、siRNA 和3-甲基腺嘌呤或羟氯喹处理膀胱癌细胞 EJ、J82,采用细胞活力分析仪和流式细胞仪分别检测膀胱癌细胞的增殖和凋亡。处理前后通过免疫印迹法评估自体吞噬情况,同时检测雷帕霉素的磷酸化哺乳动物靶点、p70核糖体蛋白 S6激酶和真核起始因子4E 结合蛋白,旨在研究自体吞噬在膀胱癌吡柔比星灌注治疗中的作用。
