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SARS冠状病毒S蛋白噬菌体抗原库的构建及筛选
本研究旨在构建SARS冠状病毒S蛋白特异性噬菌体抗原库,并用于鉴定抗S蛋白单克隆抗体的抗原表位.首先采用PCR技术扩增出SARS冠状病毒S蛋白的全基因,以DNaseI将其随机酶切成50～500 bp不同大小的DNA片段.然后将DNA片段平末端化并连接到经过改造的噬菌体表达载体pComb3XSS,经电转化大肠杆菌XL1-Blue和辅助噬菌体感染获得S蛋白的特异性噬菌体抗原库.利用两个抗S蛋白单克隆中和抗体(S-M1和S-M2)对S蛋白抗原库进行富集和筛选.结果表明,我们成功构建库容量为5.7×106的S蛋白噬菌体抗原库.通过对S-M1和S-M2的有效富集和筛选,分别得到14个和15个阳性克隆,序列分析初步揭示了抗体的抗原表位.因此,S蛋白噬菌体抗原库的构建为鉴定S蛋白的抗原表位提供了重要的技术平台,对研发SARS疫苗和诊断试剂具有重要的科学意义和应用价值.
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SARS-CoV假病毒中和试验技术的建立及评价
为避免传统的SARS病毒中和试验需要操作活毒而存在的生物安全隐患,建立了基于假病毒系统、操作较安全的SARS中和试验技术平台.本研究应用高效表达SARS-CoV S(密码子优化的全长S蛋白,简称S)的真核表达载体(pVRC8304),与HIV慢病毒包装质粒(p CMV△8.2)及转移质粒(pHR'CMV EGFP)3个质粒载体系统共同转染人胚肾细胞293T,包装了SARS假病毒;通过SARS假病毒感染的RD-A细胞中标记基因EGFP表达的分析,确定SARS假病毒能有效进入细胞,建立了可在BSL-2级实验室操作的SARS病毒中和试验技术平台.用该技术平台对不同免疫血清进行了中和抗体分析,并比较了基于假病毒和基于SARS活病毒的中和试验效果.结果显示:SARS假病毒和SARS活病毒两个中和试验系统获得中和抗体滴度变化趋势一致,表明本研究构建的SARS假病毒可替代SARS活病毒用于建立操作上安全的SARS病毒中和试验技术平台.
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血管紧张素转换酶2在大鼠胰腺组织中的表达
目的 检测SARS冠状病毒(SARS-CoV)S蛋白的功能性受体血管紧张素转换酶2 (ACE2)在大鼠内脏尤其在胰腺内、外分泌腺的表达.方法 麻醉Wistar大鼠后取胰、肺、肝、肾、心、肠、膀胱和脾8种组织,采用免疫组化和RT-PCR方法检测各组织ACE2的表达.结果 ACE2在组织中均有不同程度的表达,其中胰腺外分泌腺ACE2阳性细胞的吸光度值较内分泌腺显著增加 (P＜0.01).结论 ACE2在大鼠胰腺内、外分泌腺的表达可介导SARS-CoV侵入并损害胰腺,使胰岛素耗竭,引起血糖水平升高;同时ACE2在内脏组织的普遍表达为SARS-CoV的入侵提供了可能.
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SARS冠状病毒基础研究进展
SARS(severe acute respiratory syndrome,严重急性呼吸综合症)是严重危害人类健康的传染病,现已发现其病原体为正链RNA冠状病毒(coronavirus,CoV),SARS CoV为一类新型的冠状病毒,至今没有有效对抗其感染的药物.本文从SARS CoV的功能受体、蛋白酶、疫苗和RNA干扰技术在SARS CoV研究中的应用等方面综述了其基础研究进展,旨在为抗SARS CoV的药物研制提供一定的理论依据.
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乙型肝炎病毒S基因密码子佳化及在毕赤酵母中的高效表达
目的 制备适合酵母表达的乙型肝炎病毒S基因,在毕赤酵母中高效表达重组乙型肝炎病毒S蛋白.方法 选用酵母偏爱的同义密码子替换野生型S基因的酵母稀有密码子,采取基因搭桥法及递归式聚合酶链反应,制备合成基因,捕入酵母表达载体pPICZB.携带有合成S基因的重组质粒转化毕赤酵母菌株KM71 H,经甲醇诱导表达乙型肝炎病毒S蛋白.结果 酶切电泳及DNA测序证实合成的S基因正确克隆到表达载体中;聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹显示优化后的乙型肝炎病毒S基因在毕赤酵母中的重组蛋白表达量远高于野生型基因.结论 密码子优化的S基因能明显提高重组S蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达量.
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小鼠抗中东呼吸综合征冠状病毒刺突蛋白受体结合区单克隆抗体的筛选
目的：制备抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)刺突蛋白(S)受体结合区(receptor binding domain,RBD)的单克隆抗体(单抗),并对其特性进行鉴定。方法将昆虫-杆状病毒表达的 MERS-CoV S 蛋白 RBD 片段纯化后免疫 BALB/ c 小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 Sp2/0融合,通过有限稀释法筛选阳性克隆,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹法(Western blot)和 MERS-CoV 假病毒中和试验对所获得的细胞克隆进行筛选和鉴定。结果共筛选出12株杂交瘤细胞,ELISA 证实其分泌的单抗与 MERS-CoV S 蛋白 RBD 片段有特异反应；双抗体夹心法鉴定其中两株单抗2E4和2F3为免疫球蛋白 IgM 型,其余10株均为 IgG1型；MERS-CoV 假病毒中和试验结果显示4株单抗：1F1、2E4、3C3、3E6有中和活性；Western blot 分析表明单抗1F1、2E4、3C3、3E6能特异识别 MERS-CoV S 蛋白,而不与 SARS-CoV S 蛋白的 RBD 反应。结论我们制备了12株针对 MERS-CoV S 蛋白 RBD 的鼠源单抗,所获杂交瘤细胞株特异性强,分泌抗体性能稳定,其中4株具有中和活性。
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生酮饮食对癫痫持续状态的疗效及脑保护作用研究
目的：探讨生酮饮食( ketogenic diet,KD)治疗癫痫持续状态( status epilepticus,SE)的疗效及是否有脑保护作用,为SE患儿的合理个体化治疗及脑保护、改善预后提供新思路。方法2013年9月至2015年1月深圳市儿童医院PICU和神经内科诊断为SE的患儿均建议应用KD治疗,家属拒绝的患儿归于对照组,同意应用KD治疗的患儿为治疗组。根据SE处理原则,对照组应用传统抗惊厥治疗方法,治疗组除了给予传统药物治疗外,还给予KD治疗。治疗前及癫痫控制后抽静脉血检测神经元特异性烯醇化酶( neuron specific enolase,NSE)和S蛋白( S100β)水平,并记录癫痫获得控制的时间。结果治疗组共10例,3例患儿治疗后癫痫完全控制；6例患儿临床发作明显减少,治疗总有效率(9/10例)高于对照组(5/8例)(P<0．01)。治疗组癫痫获得控制的时间明显短于对照组[(5．2±2．9)d vs．(9．8±1．5) d,P<0．01]。治疗后,两组患儿的血清NSE和S100β水平较治疗前均有明显下降( P<0．001或P<0．05)；治疗后,治疗组患儿的血清NSE和S100β水平下降较对照组明显,差异有统计学意义(P<0．05)。结论癫痫频繁发作和SE患儿存在脑损伤,积极控制癫痫发作能减轻脑损伤严重程度,KD能有效控制癫痫发作,具有神经保护作用。
关键词： 癫痫持续状态 神经元特异性烯醇化酶 S蛋白 生酮饮食 -
ACE2在小鼠胰腺组织中的表达
目的 检测SARS冠状病毒(SARS-CoV)S蛋白的功能性受体血管紧张素转换酶2(ACE2)在小鼠胰腺内、外分泌腺的表达.方法 ① RT-PCR:麻醉小鼠后取胰腺和肺组织,采用RT-PCR方法检测各组织ACE2的表达.②免疫电镜:麻醉小鼠后取胰尾,采用免疫电镜方法检测胰腺组织ACE2的表达.结果 胰腺和肺脏组织均表达ACE2 mRNA,且胰腺内、外分泌腺均表达ACE2.结论 ACE2在小鼠胰腺内、外分泌腺的表达可介导SARS-CoV侵入并损害胰腺,使胰岛素耗竭.
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SARS冠状病毒S基因序列及细胞抗原表位预测
目的比较SARS冠状病毒各分离株S基因序列及氨基酸序列之间的差异,预测SARS-CoV的S蛋白的抗原表位.方法利用Lasergene软件包中的EditSeq从21株SARS冠状病毒分离株截取S基因序列并翻译成氨基酸序列,然后用ClustalX软件对截取序列进行比较分析,确定基准株,后用Protean软件对基准株进行抗原表位预测.结果在21株分离株的S基因中有8株核苷酸序列、13株氨基酸序列没有发生点突变;预测出78个可能性抗原表位.结论SARS-CoV的S蛋白相当保守,只发生个别点突变,可能性抗原表位多,且在其中的14个区域中可能性显著.
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SARS冠状病毒S蛋白抗原表位串联基因的设计和表达
目的:表达严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,为研制新型的SARS病毒疫苗提供新思路.方法:应用生物信息学分析软件分析SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,设计全新的抗原表位编码基因序列,构建表达载体并在大肠杆菌中表达该基因.结果:设计并合成了SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列的新基因序列,在大肠杆菌中实现了该基因的高表达.结论:可以重新设计新基因产生新型候选重组疫苗.
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SARS病毒S1蛋白的克隆、表达及其重组蛋白免疫学特性的鉴定
目的:研究SARS病毒感染后机体产生保护性免疫应答的规律和可能机制.方法:通过生物信息学分析,在原核表达系统中表达了SARS病毒S1蛋白.利用SARS流行前正常人血清和6份SARS患者恢复期的血清,对纯化的重组S1蛋白进行血清学分析.结果:研究中克隆表达的重组蛋白序列与公布的SARS病毒S1蛋白的序列相同.6份SARS患者恢复期的血清均能识别重组S1蛋白,而6份SARS流行前的正常人血清则不能与重组蛋白反应.结论:获得的重组S1蛋白具有与天然SARS病毒S1蛋白相同的序列,并具有与之相似的血清学反应性,为研究SARS病毒感染免疫应答的过程及其机制和制备SARS病毒的重组疫苗提供了良好的物质基础.
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SARS冠状病毒S蛋白C端片段基因的克隆及其DNA疫苗的免疫学研究
目的:构建抗原基因为SARS冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)S蛋白C端片段基因的DNA疫苗,采用肌注和滴鼻的方法接种小鼠后观察肌肉注射途径和黏膜途径免疫使机体产生免疫应答的情况.方法:将S蛋白C端片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),随之将重组质粒进行小鼠肌肉和黏膜免疫,定期检测外周血中抗SARS-CoV的病毒特异性抗体水平,流式细胞仪观察其淋巴细胞表型变化,免疫组化检测抗原表达分布,脾细胞增殖实验评价CTL效果.结果:疫苗注射后15天就能在血清中检测出病毒特异性抗体,随着时间的延续,抗体水平逐步升高,至30天后达到稳定,以CTL为主的CD8+T淋巴细胞的百分比含量增加极显著,引起强大的体液免疫和细胞免疫;疫苗滴鼻后45天可在鼻黏膜检测到抗原表达;而空载体质粒对照组未检测出明显的特异性免疫应答.结论:以S蛋白C端片段基因为抗原基因的DNA疫苗通过肌注和滴鼻能诱导小鼠针对SARS病毒强大的免疫应答.
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毕赤酵母表达乙型肝炎病毒preS2S蛋白的纯化和免疫效果
目的 研究重组毕赤酵母表达的乙型肝炎病毒preS2S蛋白的纯化方法及免疫效果.方法 甲醇诱导含preS2S基因的重组毕赤酵母菌,采用蔗糖区带速率离心、Butyl-S-Sepharose 4FF疏水层析和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析等方法,对表达产物进行纯化.纯化后蛋白经SDS-PAGE和Western blot方法鉴定,制备成疫苗,并进行效力试验.放射免疫法检测免疫小鼠血清抗体浓度,计算ED50和相对效力.ELISA法检测血清中的preS2S抗体.结果 纯化后的preS2(epi)S蛋白相对分子质量约为27 000,且能与特异性抗体结合.两批纯化蛋白制备的疫苗ED50分别为0.35和0.48 μg/ml,参比苗为0.52 μg/ml.2批疫苗的体外相对效力分别为1.5和1.1,均合格,血清抗体平均浓度为808和784 mIU/ml,参比苗为312 mIU/ml.2批疫苗免疫小鼠后均产生了preS2抗体.结论 该纯化方法实用有效,纯化后的preS2(epi)S蛋白比S蛋白具有更好的免疫原性.
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SARS病毒S1蛋白重组C端片段免疫效果的实验研究
为获得纯化的重组SARS病毒S1蛋白C端,研究其刺激机体产生针对SARS病毒免疫应答的规律和机制,将编码SARS病毒S1蛋白C端311个氨基酸残基的基因克隆,并在原核表达系统中表达,纯化获得了的重组蛋白.利用SARS患者恢复期的血清,对纯化的重组S1蛋白进行血清学分析.结果表明,本研究中克隆表达的重组蛋白序列与公布的SARS病毒S1蛋白C端的序列相同,其编码的重组蛋白相对分子质量约为59 000 Mr.SARS患者恢复期的血清均与重组蛋白反应,在59 000 Mr处形成特异性的反应条带,而来自SARS流行前的正常人对照血清则不能与重组蛋白反应.在本研究中获得的重组蛋白可以为研究SARS病毒识别宿主细胞受体的过程及其机制提供条件.
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SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Vero细胞中的表达
目的构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体,并将其置于Vero细胞中表达.方法设计1对PCR引物,在其下游引入Flag序列,通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出S蛋白编码基因, PCR产物经酶切后,插入表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SARS-S.重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞,用抗Flag单克隆抗体通过Western blot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达.结果酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确;Western blot证实重组S蛋白片段能够在Vero细胞表达.结论融合Flag序列的SARS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达.
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医院就诊人群HBsAg与抗HBs双阳性HBV感染者的流行病学与分子病毒学特征
目的 探讨乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和抗HBsAg抗体(抗HBs)同时阳性的HBV感染者的流行病学及分子病毒学特征.方法 分析52 070例医院就诊人群HBV血清学标志物检测结果,以HBsAg和抗HBs双阳性患者为实验组,HBsAg阳性、抗HBs阴性患者为对照组,比较2组患者的流行病学特征.半巢氏PCR扩增2组患者HBV S蛋白编码区并测序,比较2组间在不同基因区、基因型及临床诊断时的统计学差异.结果 医院检测人群HBsAg阳性率为20.40％ (10 621/52 070),其中HBsAg、抗HBs双阳性率为2.48％ (263/10 621).HBsAg、抗HBs双阳性在0～9岁和≥80岁人群流行率较高,而HBsAg阳性、抗HBs阴性则相反.实验组S蛋白氨基酸突变率显著高于对照组(1.52％ vs 0.81％,P＜0.01),差异主要存在于主要亲水区(MHR)(1.68％vs0.57％,P＜0.01).实验组中除肝癌(HCC)患者外(1.97％ vs 2.21％,P＞0.05),乙肝携带者、慢性乙型肝炎(CHB)患者和肝硬化(LC)患者的S蛋白突变率均显著高于对照组同疾病患者(分别为1.47％ vs 0.65％,1.28％ vs0.84％,2.21％ vs 0.44％,P均＜0.05).结论 HBsAg、抗HBs双阳性以0～9岁和≥80岁HBsAg阳性人群更多见.HBV感染者血清HBsAg和抗HBs共存可能与S蛋白(主要为MHR)的突变造成的免疫逃逸有关.HBsAg、抗HBs双阳性和HBsAg阳性、抗HBs阴性患者之间S蛋白的突变率差异与患者肝脏疾病所处的阶段有关.
关键词： 乙型肝炎病毒表面抗原 抗乙型肝炎病毒表面抗原抗体 突变 S蛋白 -
SARS-CoV由果子狸向人类跨种传播中S蛋白的适应性进化研究
目的: 研究SARS-CoV表面S蛋白由动物向人类跨种传播过程中的适应性进化过程.方法: 用系统进化树构建和群体遗传学方法,对100个S基因序列进行了分析.这些序列均从GenBank获得,并能反映整个SARS流行期.结果: 依据系统进化树和流行病学资料,将SARS病毒分为三个流行群:02-04跨种传播群、03-早中期流行群和03-晚期流行群.它们分别代表SARS-CoV克服种间障碍实现跨种传播阶段、进入人类后的初适应阶段以及在人类中建立感染后的阶段.在前两个流行群中,S蛋白受到了阳性选择压力,而在03晚期流行群中却遭受了很强的负选择压力.三个流行群选择压力的比较显示,SARS-CoVs从动物向人类跨种传播过程中,S蛋白受到的阳性选择压力依次减小.结论: 从初的阳性选择到后的负选择,S蛋白经历了变化的自然选择压力.这种变化的选择压力不仅反映了SARS-CoV由动物向人类跨种传播的适应性进化过程,也为研究其他病毒的跨种传播机制提供重要线索.
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SARS病毒膜融合抑制剂的鉴定
目的:用分子对接技术预测HIV融合抑制剂是否能对SARS起作用.方法:搜寻HIV gp41融合抑制剂,用DOCK软件分析其与SARS蛋白的S2结构域HR1三聚体晶体结构的亲和力.结果:预测了23个小分子,ADS-J1、ADS-J2、XTF Formazan等几个小分子得分较高,提示与S2结构域有亲和力.结论:发现抗HIV的融合抑制剂有可能对SARS起作用.
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SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立
目的:构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法: 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1+SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9+SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果: 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论: SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.
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SARS冠状病毒S蛋白基因片段的表达及其单克隆抗体的制备
目的: 表达SARS冠状病毒S蛋白片段,并制备特异性单克隆抗体(mAb).方法: 原核表达SARS冠状病毒S蛋白片段,从SARS病毒cDNA中扩增S蛋白(N端205至419aa)基因片段,测序结果正确.将该基因片段插入pQE-30中,构建重组质粒pQE-30-S1m,以重组质粒转化E.coli M15诱导表达His-S1m蛋白.纯化后免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb.结果: 表达并纯化了重组蛋白His-S1m,获得1株抗His-S蛋白的mAb1H2.Ig亚类鉴定为IgG1a,轻链为κ型.经Western blotting检测,mAb1H2与S蛋白发生特异性反应,而与His蛋白无交叉反应.结论: 成功表达了重组S蛋白并制备了特异性mAb,为SARS-CoV的早期诊断及进一步研究S蛋白的功能奠定了基础.
