斯氏按蚊产卵前后不同器官对伯氏疟原虫出丝诱导活性的影响

为分析斯氏按蚊产卵与头、唾液腺和卵巢组织中出丝诱导活性动态的相互关系,应用雄配子体体外出丝检测雌性斯氏按蚊产卵前后头、唾液腺及卵巢抽提物对伯氏疟原虫雄配子体出丝诱导活性的动态变化.结果表明:产卵前后各时相点之间-头部抽提物的出丝诱导活性未发生有意义的变化.吸血后1 h内按蚊唾液腺抽提物的出丝诱导活性显著下降,产卵翌日恢复到吸血前水平;卵巢匀浆上清的诱导活性亦在吸血后下降,吸血后第2日显著升高,产卵翌日回落.斯氏按蚊唾液腺和卵巢的出丝诱导活性在产卵后相互消长,这些变化可能与蚊卵的发育、成熟及产出相关.

按蚊中肠前酚氧化酶原与约氏疟原虫卵囊黑化的关系

目的分析约氏疟原虫卵囊黑化期间按蚊中肠内前酚氧化酶原(Prophenoloxidase,PPO)的变化,探讨中肠PPO与疟原虫卵囊黑化的关系. 方法解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后3、5、7、11和15 d斯氏与大劣按蚊中肠,匀浆后经SDS-PAGE和转膜,以抗烟草天蛾PPO的抗体进行免疫印迹分析,并于感染后第5 d开始在镜下观察约氏疟原虫卵囊黑化情况,直至第15 d止. 结果斯氏与大劣按蚊中肠在约氏疟原虫感染前和感染后的不同时期经免疫印迹均可检测到1条分子质量约为67 ku的PPO阳性蛋白带,但感染后的PPO蛋白带比感染前明显增强,而且同时间点大劣按蚊中肠PPO蛋白带比斯氏按蚊明显,尤其在感染的后期大劣按蚊中肠PPO蛋白带明显比斯氏按蚊增强;在感染后7 d可见大劣按蚊中肠内发育的约氏疟原虫卵囊部分黑化,在15 d时可见疟原虫卵囊完全黑化. 结论按蚊中肠PPO含量增加,尤其是长时间内维持在较高水平与约氏疟原虫卵囊黑化密切相关.

丝氨酸蛋白酶级联相关性斯氏按蚊血细胞分析

目的分析与丝氨酸蛋白酶级联相关性的斯氏按蚊血细胞.方法采用姬氏染色法观察血细胞类型,并利用免疫细胞化学技术检测斯氏按蚊血细胞内前酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶,对酶学定位阳性细胞类型进行初步鉴定.结果经姬氏染色,斯氏按蚊血细胞主要为颗粒细胞,前酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶主要分布于颗粒细胞和浆细胞内.结论斯氏按蚊血细胞可结构性表达前酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶,颗粒细胞和浆细胞可能为丝氨酸蛋白酶级联成分来源的主要细胞类型.

按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶与疟原虫卵囊黑化关系研究

目的探讨丝氨酸蛋白酶与疟原虫卵囊黑化的相互关系. 方法将斯氏按蚊分为吸糖水组、吸正常小白鼠血组、吸约氏疟原虫感染血组和吸硝喹糖水组,挤压法收集雌斯氏按蚊血淋巴,Bradford法检测血淋巴蛋白浓度,继而对血淋巴进行SDS-PAGE,电转移后检测丝氨酸蛋白酶的表达差异. 结果 4 组斯氏按蚊丝氨酸蛋白酶Western印迹均呈现两条带,分子质量分别约 160和150 ku,与吸糖水组比较,吸正常小白鼠血组丝氨酸蛋白酶表达稍高,而感染约氏疟原虫后斯氏按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶表达明显增强,感染第6 d达高峰,之后表达下调,而硝喹诱导黑化后丝氨酸蛋白酶表达水平呈逐日下调趋势. 结论斯氏按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶参与了疟原虫卵囊黑化包被反应.

蚊虫抗药性机制研究进展

所谓抗药性，是指昆虫具有耐受杀死正常种群大部分个体的药量的能力在群体中发展起来的 现象〔1〕。其特点是受遗传物质所控制，可以遗传。　　抗药性的产生是连年大量使用杀虫剂，长期选择的结果。蚊虫对不同的杀虫剂产生抗性的机 制不同，由单因子的作用，也有多因子的联合作用，一般可分为生化抗性、生理抗性和行为 抗性3种类型。生理生化机理的改变是产生抗性的直接原因，各种抗性基因控制生理生化机 理的改变。1　生化抗性　　生化抗性主要是由于解毒作用增强、代谢加速而引起的，又称代谢抗性。代谢抗性涉及的 解毒酶主要有酯酶、多功能氧化酶和谷胱甘肽-S-转移酶等。1.1　酯酶　蚊虫体内酯酶是对杀虫剂解毒的重要水 解酶之一，它普遍存在于蚊虫体内各种组织中，参与酯类杀虫剂的解毒作用。酯酶在对有机 磷的抗性中起着极为重要的作用，在对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯的抗性中也起一定作用。　　酯酶在抗性机理中具有两重作用，即通过结合和/或水解杀虫剂发挥解毒作用。对二甲基磷 酸酯（如马拉硫磷）和杀灭菊酯来讲，水解是主要的，结合是次要的；对其他有机磷的氧类 似物和氨基甲酸酯来讲，作为一种结合蛋白，结合是主要的，水解是次要的。水解作用的结 果产生无毒的离子，结合作用的结果酯酶被杀虫剂磷酰化或氨基甲酰化，使杀虫剂不能到达 靶标。而两者均能起到保护体内靶标--乙酰胆碱酯酶免受抑制。羧酸酯酶对有机磷的亲和 力远远大于乙酰胆碱酯酶，有机磷对羧酸酯酶抑制程度比对乙酰胆碱酯酶强烈，羧酸酯酶虽 被抑制，但蚊虫却没有中毒症状，而乙酰胆碱酯酶的抑制是致命的。　　国内外研究证明了蚊虫体内酯酶活力与对杀虫剂抗性的关系。蚊虫对有机磷的抗性增加往往 伴随着羧酸酯酶活力增加。如淡色库蚊对马拉硫磷和敌百虫的抗性程度与羧酸酯酶活力呈 平行关系〔2〕；环跗库蚊、斯氏按蚊对马拉硫磷的抗性与其羧酸酯酶活力增加有关 〔3〕。酯酶活力增加在淡色库蚊对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯的抗性中 起一定的作

斯氏按蚊性别决定基因fruitless的鉴定及其性别可变剪接分析

目的 分离、鉴定和分析斯氏按蚊性别决定基因fruitless(Anstfru).方法 通过生物信息学方法与分子生物学方法获得了Anstfru基因的全长.通过RT-PCR方法验证Anstfru的性别可变剪接模式与时间表达特点.通过与已知物种FRU蛋白比较,分析斯氏按蚊FRU蛋白结构特点与分子进化特征.结果 分离并鉴定Anstfru基因全长,其在雌、雄蚊中通过可变剪切形成性别特异性mRNA.Anstfru在1～2龄阶段幼虫阶段开始表达,表达量随后逐渐升高,在成蚊中表达量高.FRU蛋白具有保守的BTB与锌指功能结构域区.结论 Anstfru具有保守的昆虫性别决定基因fru表达特征与功能结构域,对其深入研究将为其终应用于蚊虫雌雄分离技术,推动昆虫不育技术(Sterile insect technique,SIT)在蚊媒传染病防治上的应用.

色氨酸对疟原虫配子体激活因子的影响

目的探讨色氨酸代谢产物对斯氏按蚊唾液腺抽提物中疟原虫配子体激活因子的影响.方法应用柏氏疟原虫体外雄配子体出丝分析方法检测果糖喂饲液中掺入色氨酸后斯氏按蚊唾液腺抽提物疟原虫配子体激活因子的活性变化.结果斯氏按蚊唾液腺中柏氏疟原虫配子体激活因子与按蚊生长发育程度呈同步变化;喂饲液中掺入色氨酸可增强按蚊唾液腺的出丝诱导活性.结论喂饲液中掺入色氨酸可提高斯氏按蚊唾液腺中疟原虫配子体激活因子的含量.

免疫电镜观察定位于斯氏按蚊胃的伯氏疟原虫环子孢子蛋白及血小板反应素相关粘附蛋白

按蚊TEP1基因与硝喹诱导疟原虫卵囊黑化反应的相关性

目的 对斯氏按蚊TEP1基因与抗疟药硝喹诱导约氏疟原虫卵囊黑化反应的相关性进行初步研究.方法 斯氏按蚊吸血感染约氏疟原虫后,随机分为两组(各300只),A组喂饲含0.1%硝喹蔗糖水,B组喂饲10%蔗糖水.另设正常对照组(C组),常规蔗糖水饲养.分别于用药后第1、2、3和4天,取各组雌蚊的血淋巴(各50只),提取cDNA模板,设计引物,克隆斯氏按蚊TEP1基因,用荧光定量PCR检测TEP1基因在抗疟药硝喹诱导下的变化;同时解剖各组雌蚊(各25只),光镜观察约氏疟原虫卵囊的黑化情况,分析TEP1基因与抗疟药诱导的黑化反应的关系.结果 成功克隆TEP1基因,推测其氨基酸序列含有TEP分子高度保守的硫酯序列区(GCGEQ).荧光定量PCR检测结果 显示,抗疟药硝喹可诱导斯氏按蚊TEP1基因表达上调,于诱导后第3天,A组的TEP1基因相对表达量为2.423,是B组(1.036)的2.5倍,两者差异有统计学意义(P<0.05).相同时点,光镜观察显示,A组蚊经硝喹诱导后的约氏疟原虫卵囊出现黑化现象,黑化率约14.0%,而B组则未发现有黑化现象.结论 抗疟药物硝喹可诱导斯氏按蚊TEP1基因上调.该基因与约氏疟原虫卵囊黑化相关.

抗斯氏按蚊中肠蛋白组分的抗体对约氏疟原虫卵囊的作用

目的 观察抗斯氏按蚊中肠蛋白组分的抗体对约氏疟原虫卵囊的抑制作用.方法 解剖实验室饲养斯氏按蚊雌蚊,取中肠(胃)制备中肠蛋白抗原并免疫BALB/c小鼠(8只,100 μg/只),共免疫4次,每次间隔7～10 d,末次免疫后10 d,腋窝动脉取血,分离血清.用蛋白质印迹(Western blotting)分析中肠蛋白的免疫活性抗原.用葡聚糖凝胶过滤法获得相对分子质量(Mr)为38 000～50 000的蛋白.用该中肠蛋白免疫小鼠(12只,100 μg/只),共免疫4次,每次间隔7～10 d.同时设PBS对照组.末次免疫后7 d,ELISA检测小鼠血清中的抗体,抗体效价≥1∶2 560时,该免疫组小鼠和对照组小鼠经腹腔接种感染约氏疟原虫(约含2×107个感染疟原虫的红细胞),感染后3 d取小鼠尾血镜检,雌配子体数＞2/10个视野的小鼠作为供血鼠,斯氏按蚊成蚊吸血后9 d解剖,计数中肠的卵囊数量.结果 Western blotting显示斯氏按蚊中肠蛋白抗原的显色区带有8条,其中Mr 38 000～50 000的区带显色较清晰;实验组和对照组中肠卵囊感染率分别为28.70%(62/216)和51.09%(47/92)(P＜0.05),中肠卵囊指数分别为14.14(1 541/109)和26.02(1 223/47),两者差异有统计学意义(P＜0.01).结论 斯氏按蚊Mr 38 000～50 000中肠蛋白有免疫活性;针对该中肠蛋白的抗体对约氏疟原虫卵囊的发育有明显的抑制作用.

斯氏按蚊转录因子Relish基因克隆、定位及不同食源条件下表达

目的对斯氏按蚊转录因子Relish基因进行克隆、定位和差异分析,初步探讨转录因子Relish在前酚氧化酶(PPO)级联与疟原虫卵囊黑化中的信号调控作用.方法设计简并引物,对全蚊eDNA模板进行RT-PCR扩增,产物纯化、克隆、测序和鉴定,利用特异引物分别从血细胞或中肠扩增目的基因,于不同食源条件下进行半定量分析和原位核酸分子杂交定位.结果获得了1种斯氏按蚊Relish cDNA部分序列,与冈比亚按蚊Relish基因很相似,并存在于中肠和血细胞,半定量分析显示,感染约氏疟原虫6、12、24和48 h或吸硝喹糖水12和24 h,于诱导约氏疟原虫卵囊黑化之前表达明显增强,原位核酸分子杂交证实血细胞和中肠有表达.结论斯氏按蚊转录因子Relish可能在疟原虫感染或/和约氏疟原虫卵囊黑化调控中发挥重要作用.

斯氏按蚊血淋巴蛋白浓度的检测及其意义

目的了解斯氏按蚊成蚊在不同食源条件下血淋巴蛋白浓度的变化.方法挤压法分别收集4组(吸蔗糖水组、吸正常血组、吸感染血组和吸硝喹组)斯氏按蚊成蚊血淋巴,采用Bradford法测定血淋巴蛋白浓度,并进行Excel自动分析.结果吸血感染约氏疟原虫8 d后,吸感染血组血淋巴蛋白浓度高于吸蔗糖水组和吸正常血组,平均分别为4.436、3.080和3.092μg/μl,通常硝喹组浓度(2.264μg/μl)低于吸感染血组.结论吸硝喹组蚊体内血淋巴蛋白浓度下降,提示蚊血淋巴蛋白可能参与疟原虫卵囊的黑化包裹反应.

蚊媒感染疟原虫后应答性表达增高基因的富集和筛选

目的分离和识别蚊媒疟原虫感染相关基因并探讨其机制.方法以斯氏按蚊-约氏疟原虫为实验模型,分别将刺叮约氏疟原虫感染鼠血和正常鼠血后24 h的饱血斯氏按蚊作为T组和D组,经抑制性差减杂交和选择性PCR扩增,建立一个T组表达特异增高基因的差减cDNA库.将此差减库分别与T组和D组的cDNAs混合探针作斑点杂交,筛选出差异表达基因,测定其序列并做基因库BLAST搜索.结果T组相对于D组的差异表达基因得到有效富集,58个重组克隆中有24个表达增高,阳性率为41.4%.所代表的23个基因搜索结果显示,12个与功能已知的基因同源,4个与功能未知的基因同源,7个为新发现的基因;其中9个与LPS诱导的冈比亚按蚊免疫反应性细胞系EST同源,占39.1%(9/23).结论建立了蚊媒感染疟原虫早期(24 h)直接导致的全基因组应答性表达增高cDNA库,筛选结果显示蚊虫对疟原虫感染的反应涉及多种生化途径及机制,尤其与天然免疫系统和能量代谢关系密切.

斯氏按蚊血淋巴酚氧化酶与约氏疟原虫卵囊黑化的关系

[目的]探讨酚氧化酶(phenoloxidase,PO)与疟原虫卵囊黑化的关系.[方法]以斯氏按蚊/约氏疟原虫为模型,对4组斯氏按蚊(不吸血组、吸正常血组、吸感染血组和硝喹组)血淋巴进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和凝胶图像分析,检测单酚氧化酶(monophenoloxidase,MPO)和二酚氧化酶(diphenoloxidase,DPO)活性.[结果]吸正常血组和不吸血组蚊血淋巴中MPO及.O-DPO活性无明显差异;与吸正常血组或不吸血组相比,感染组MPO及o-DPO活性无明显变化,但用药组d10则显著增加,d15显著降低.[结论]斯氏按蚊血淋巴中PO活性变化与约氏疟原虫卵囊黑化在时间上一致.

促疟原虫配子发育因素的体外观察

宿主血液中的疟原虫配子体是通过蚊体内发育再传染.蚊虫吸血数秒钟后,被摄人蚊胃内的配子体即开始向配子发育.体外实验证实,在室温20℃条件下,增高培养液的pH可促使配子形成[1].体内实验表明,在埃及伊蚊(Aedes aegypti)的胃和头部及斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的头部和肛部提取物中存在促配子形成的物质[2-4],Billker等[5]在蚊的头部发现能促疟原虫配子体在蚊体内形成配子的物质--黄尿烯酸.

斯氏按蚊配子体激活因子活性变化与产卵的关系

目的 探讨斯氏按蚊唾液腺中疟原虫配子体激活因子的变化趋势与蚊卵发育及产出的关系.方法 应用体外雄配子体出丝观察方法检测雌性斯氏按蚊唾液腺抽提物及卵巢匀浆上清中配子体激活因子对伯氏疟原虫雄配子体出丝诱导活性的动态变化;分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和Bradford蛋白分析法检测两器官蛋白成分或含量的变化.结果 吸血后按蚊唾液腺抽提物的出丝诱导活性显著下降,未产卵组和产卵组按蚊的活性分别于吸血后第8日和第4日恢复到吸血前水平;卵巢匀浆上清的诱导活性亦在吸血后下降,吸血后第2日显著升高,未产卵组保持该活性水平至吸血后第8日,产卵组诱导活性于吸血后第4日(产卵翌日)回落.两组按蚊唾液腺蛋白组成未见明显区别;吸血后第2日,卵巢的蛋白含量达到峰值,未产卵组按蚊卵巢蛋白含量维持在高水平直至吸血后第6日,而产卵组按蚊卵巢蛋白含量在吸血后第4日则恢复到吸血前的水平.结论 按蚊唾液腺中配子体激活因子的消长与雌蚊体内蚊卵的发育、成熟及产出之间存在某种内在的生理联系.

斯氏按蚊丝氨酸蛋白酶基因克隆及其与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的克隆斯氏按蚊丝氨酸蛋白酶基因,分析该分子与约氏疟原虫卵囊黑化关系.方法根据其它昆虫丝氨酸蛋白酶的保守氨基酸序列设计简并引物,以斯氏按蚊全蚊cDNA为模板,进行RT-PCR扩增,PCR产物纯化,克隆入pUCm(T载体,测定插入片段序列,对序列进行BLAST检索和鉴定,根据序列设计相应基因的特异引物,然后分别从血淋巴细胞或中肠扩增目的基因,并进行不同食源条件下丝氨酸蛋白酶基因的半定量、原位核酸分子杂交定位与约氏疟原虫卵囊黑化关系的分析.结果获得了2种斯氏按蚊血细胞丝氨酸蛋白酶cDNA部分序列,即AsSP1(448bp)和AsSP2(472bp),分别与冈比亚按蚊SP2A和大劣按蚊SP2基因很相似,其编码的氨基酸序列均包含保守的丝氨酸蛋白酶催化功能域.在中肠和血淋巴内也获得相同的目的基因片段,半定量分析显示约氏疟原虫感染或诱导卵囊黑化呈现之前的表达明显增强,原位核酸分子杂交技术也进一步证实血细胞有AsSP1和AsSP2 mRNA表达.结论 AsSP1和AsSP2很可能与疟原虫感染或约氏疟原虫卵囊黑化相关,推测可能是斯氏按蚊的前酚氧化酶的活化酶.

斯氏按蚊血细胞对约氏疟原虫卵囊黑化的影响

目的探讨斯氏按蚊血细胞及血细胞PPO 对疟原虫卵囊黑化的影响.方法利用电镜观察蚊血细胞在卵囊黑化中的作用、RT-PCR检测蚊血细胞、蚊胃中PPO mRNA的表达、原位杂交检测血细胞中PPO mRNA的表达.结果通过RT-PCR和原位杂交,发现斯氏按蚊PPO mRNA在血细胞中有表达,颗粒细胞可能是其主要的表达细胞;硝喹可使约氏疟原虫卵囊发生退行性变,卵囊黑化比率明显增加.结论说明血细胞能够合成PPO,进一步证实了蚊血细胞,特别是硝喹对卵囊的发育有抑制和阻断作用时,颗粒细胞在疟原虫卵囊黑化中起重要作用.

斯氏按蚊和中华按蚊中肠免疫活性抗原的研究

目的鉴别斯氏按蚊和中华按蚊中肠具有阻断疟疾传播作用的免疫活性蛋白,并对斯氏按蚊雌蚊中肠免疫活性蛋白在中肠的分布进行定位.方法应用酶联免疫电转移印迹技术(EITB)分析斯氏按蚊雌、雄蚊和中华按蚊雌蚊中肠的免疫活性抗原;用间接荧光抗体技术(IFA)对斯氏按蚊雌蚊中肠免疫活性抗原进行定位.结果斯氏按蚊雌、雄蚊蚊中肠抗原及中华按蚊雌蚊中肠抗原与斯氏按蚊雌蚊中肠抗血清作用,分别显示9、9和6条蛋白带;斯氏按蚊雌蚊中肠壁外侧出现较强的亮绿色荧光,肠壁细胞核仅出现样弱的亮绿色荧光.结论上述三种抗原间既有相同的免疫活性蛋白带,也有各自特异的蛋白带,79、76、60、46kDa的蛋白带为斯氏按蚊雌蚊中肠特异性免疫活性蛋白带;斯氏按蚊雌蚊中肠免疫活性蛋白主要分布在中肠肠壁外侧,仅有少量分布在肠壁细胞核.

苏云金杆菌对斯氏按蚊Hor株幼虫杀伤效果的分析

目的 检测苏云金杆菌以色列亚种(Bti)对斯氏按蚊Hor株四龄幼虫的杀灭效果及作用特点,为合理使用Bti进行蚊虫防治提供参考标准和理论依据.方法 首先采用Probit analysis生物测定的方法研究Bti剂量与斯氏按蚊幼虫累计死亡率的关系,通过线性回归分析获得相关公式,计算半致死浓度(LC50)等重要参数,探讨Bti对斯氏按蚊的杀伤效果.然后利用半致死浓度的Bti处理不同密度的斯氏按蚊幼虫,分析按蚊幼虫密度对Bti杀伤效果的影响.结果 Bti对斯氏按蚊四龄幼虫的累计死亡率随作用时间和浓度的升高而增大,Bti的浓度对数值与累计死亡率P值呈较好的线性关系,根据所获得的公式计算出Bti作用12、24、48和72h后,半数致死浓度(LC50)分别为(1242±60)IU/L、(1112±45)IU/L、(1010±73)IU/L、(855±32)IU/L,95％致死浓度(LC95)分别为(4 170±138)IU/L、(3746±444)IU/L、(3462±409)IU/L、(3080±464)IU/L.而且随着幼虫密度的增加,其累计死亡率显著降低.结论 Bti株对斯氏按蚊四龄幼虫具有较好的杀伤效果,作用强、起效快,是一种较为理想的的灭蚊生物制剂;在Bti的使用剂量的确定上,应充分考虑蚊虫密度的因素,蚊虫密度越大所需Bti剂量应适当加大.