艾美耳球虫子孢子从宿主细胞中逸出机制的初步研究

艾美耳球虫是一类重要的肠道病原，其裂殖生殖阶段的虫体逸出过程是造成畜禽肠道破坏的主要原因之一，但此逸出过程的机制仍鲜有报道。本研究以乙醇作为诱导剂研究柔嫩艾美耳球虫M2 e株子孢子从宿主细胞中逸出的机制。结果显示，乙醇可诱导子孢子从MDBK细胞中逸出，此逸出过程依赖于虫体的运动能力；同时，乙醇可激发子孢子逸出相关的微线体蛋白2（ Mic2）的分泌释放。进一步实验证实，螯合虫体内部钙离子明显阻断了子孢子逸出及Mic2蛋白的释放。本研究初步证实了与柔嫩艾美耳球虫逸出相关的蛋白和离子，为深入解析球虫致病的分子机制、研发新型抗球虫药物提供了新的研究方向。

抗隐孢子虫子孢子ScFv-PE40免疫毒素表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

用PCR方法扩增抗隐孢子虫子孢子ScFv片段,插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28-ScFv,然后,将绿脓杆菌外毒素(PE40)片段定向克隆到ScFv基因的下游,构建免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40.经酶切分析、PCR检测和测序进行鉴定.成功地构建了免疫毒素表达质粒pET28 ScFv-PE40.将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,成功地表达了目的蛋白.免疫毒素ScFv-PE40大小约为66kDa,表达量约占菌体蛋白总量的14%.

抗隐孢子虫子孢子表膜单链抗体4G4的基因克隆及序列测定

应用RT-PCR技术,从分泌抗隐孢子虫表膜单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞4G4中,扩增出抗体VH和VL基因,用Linker(Gly4Ser)3基因,将VH和VL基因连接成ScFv基因,并将其克隆至pMD-18T载体中.经核甘酸序列分析证实,VH和VL基因及Linker基因拼接正确,基因全长717bp,经计算机分析,VH和VL基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征.

约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白的二维电泳-质谱分析

目的分离和鉴定约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白,找出疟原虫子孢子侵入相关蛋白.方法采用二维蛋白电泳技术分离感染和未感染约氏疟原虫的斯氏按蚊中肠和唾液腺差异表达蛋白,考马斯亮蓝染色,BIO-RAD凝胶扫描仪和PDQUest图象软件分析,差异蛋白点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其肽质指纹图谱,用Mascot在相应的查询条件下搜索NCBInr数据库.结果获得了分辨率和重复性均较好的一维和二维蛋白图谱.凝胶扫描结果发现未感染蚊中肠有135个蛋白点,感染蚊中肠有158个蛋白点,相同有107个,pI偏酸性.未感染蚊唾液腺有178个蛋白点,感染蚊唾液腺有201个蛋白点,相同有167个,pI分布较均匀.选择7个差异蛋白点进行分析,得到了6个蛋白肽质指纹图谱,查询数据库初步鉴定疟原虫来源的蛋白质有5个,另1个来源于蚊组织.疟原虫来源蛋白为一些表面蛋白、代谢和运动相关的蛋白等.结论建立了一种较好的疟原虫子孢子蛋白分离和鉴定方法,并证明约氏疟原虫唾液腺子孢子表达大量差异表达蛋白,部分可能与其识别、侵入宿主细胞有关.

温度对蚊虫发育历期的影响及与疾病的关系

目的:观察温度对蚊虫发育历期的影响及与疾病发生的关系.方法:在实验室不同恒温条件下,观察中华按蚊各虫期发育情况及间日疟原虫在该蚊体内子孢子繁殖时间;用直线回归公式求出各虫期发育起点温度(C值)和有效积温(K值日度).结果:蚊虫各历期均以25～28℃时发育时间短,繁殖快;蚊虫体内子孢子增殖快,密度高.并结合不同地区气温,预测了各地蚊虫生长繁殖的高峰期为7～9三个月,证实与疟疾流行情况相一致.结论:蚊虫的发育历期随温度升高而缩短;间日疟原虫子孢子在中华按蚊体内增殖,温度以25～28℃为适宜.

疫苗预防疟疾(红细胞前期)

背景:抗各期疟原虫的疫苗正在研制中,主要是针对引起严重疟疾的恶性疟原虫.红细胞前期疫苗的作用是通过攻击子孢子和到达血流前的肝脏期疟原虫,预防或延迟疟疾发作.

疟原虫环子孢子蛋白参与子孢子对蚊唾液腺的入侵/用一种新颖的DNA微量荧光分析法评价抗疟药活性

疟原虫感染性子孢子与宿主细胞作用的分子机制研究进展

疟原虫3个感染阶段中的裂殖子入侵细胞的全过程已基本清楚,而对子孢子入侵蚊唾液腺和动物肝细胞的过程还不十分清楚.其基本过程与其它顶端复合体类似,为配体-受体结合模式,即分子间的相互作用.本文就近年来关于疟原虫子孢子侵袭蚊唾液腺、感染性子孢子入肝途径、粘附和入侵肝细胞的分子机制研究进展进行综述.

免疫电镜观察定位于斯氏按蚊胃的伯氏疟原虫环子孢子蛋白及血小板反应素相关粘附蛋白

123恶性疟原虫:用定向标记消减杂交法获取富集子孢子特异转录本的cDNA文库

疟原虫红前期的肽亚单位疫苗

用射线致弱的子孢子实验性免疫动物和人可诱导抗疟疾感染免疫力,表明了研制有效疟疾疫苗的可行性.由于缺乏体外培养系统,大量应用射线致弱的子孢子做疫苗是不可行的.含有不同抗原表位的合成肽亚单位疫苗可作为替代品.目前,表达子孢子和/或肝期T、B细胞表位的亚单位疫苗已用于实验动物,它们具有很强的免疫原性且能诱导抗体和CD4+T、CD8+T细胞介导的保护性免疫.

老挝占巴塞省按蚊种类及其疟原虫子孢子感染情况调查

目的 对老挝占巴塞省按蚊种类及其疟原虫子孢子感染情况进行调查,为当地疟疾防治措施的制定与评估提供参考. 方法 2017年7月在老挝占巴塞省巴通坡县采用诱蚊灯通宵诱蚊法和通宵人诱法进行捕蚊,对捕获的成蚊进行形态学鉴定,取部分雌性按蚊提取基因组DNA,巢式PCR检测恶性疟原虫和间日疟原虫的18S rRNA基因,计算按蚊疟原虫子孢子阳性率. 结果 共捕获蚊虫34 687只,分属库蚊、按蚊和伊蚊等8个属的29个种.库蚊属为当地优势属,占捕获蚊虫总数的92.6％ (32 11 0/34 687);其次是按蚊属,占5.6％(1 947/34 687).迷糊按蚊是按蚊属的优势种,占该属的65.5％ (1 275/1 947);其后是可赫按蚊,占12.1％(235/1 947);菲律宾按蚊,占11.9％ (232/1 947);中华按蚊,占5.1％(100/1 947).巢式PCR共检测按蚊336只(可赫按蚊234只、中华按蚊100只和大劣按蚊2只),8只按蚊间日疟原虫子孢子阳性,阳性率为2.4％(8/336).其中,可赫按蚊子孢子阳性6只,阳性率为2.6％ (6/234);中华按蚊子孢子阳性2只,阳性率为2.0％(2/100);均未检测到恶性疟原虫子孢子.巢式PCR扩增片段长120 bp,其序列与间日疟原虫序列(GenBank登录号为:KT991325、KT991317、MG708221、MF540772、LT635613、KU569498、AF145335、KT991314和KX007932)的同源性为99％～100％. 结论 老挝占巴塞省捕获的可赫按蚊和中华按蚊存在间日疟原虫子孢子自然感染,且阳性率均较高.

ELISA检测云南按蚊环子孢子蛋白的评价

目的采用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术检测疟疾媒介按蚊环子孢子蛋白(CSP),评价ELISA用于云南疟疾媒介按蚊传疟效能调查的可行性.方法现场捕获疟疾媒介按蚊经产蚊,每只蚊镜检3叶唾腺子孢子感染率,ELISA检测另3叶唾腺CSP;用含间日疟原虫配子体的患者血人工喂饲微小按蚊,11d后同法镜检唾腺子孢子感染率及ELISA检测唾腺CSP.在种植场捕获8种按蚊(微小按蚊、中华按蚊、多斑按蚊、迷糊按蚊、可赫按蚊、带足按蚊、菲律宾按蚊和须喙按蚊)各龄成蚊,ELISA检测唾腺CSP.结果①现场捕获经产蚊1 010只,镜检唾腺子孢子阳性7只,阳性率为0.69%;ELISA检测唾腺CSP阳性8只,阳性率为0.79%;其中6只蚊两项检测均为阳性,阳性率为0.59%.两法比较,差异无显著性意义(P＞0.05).②人工感染36只微小按蚊,镜检唾腺子孢子阳性27只,阳性率为75.0%;ELISA检测唾腺CSP阳性29只,阳性率为80.6%;其中有26只蚊两项检测(Pv210 CSP)均阳性,阳性率为72.2%.两法比较,差异无显著性意义(P＞0.05).③种植场捕获8种按蚊各龄成蚊4 675只,ELISA检测唾腺CSP阳性11只,阳性率为0.24%;其中Pv210阳性9只,Pf2A10阳性2只;微小按蚊、中华按蚊和多斑按蚊ELISA检测阳性率分别为0.20%、0.24%、0.39%.结论 ELISA是检测按蚊传疟效能的有用方法.

微小隐孢子虫cDNA文库的构建及P23、CP15/60基因的克隆

目的微小隐孢子虫地方株cDNA文库构建及P23、CP15/60基因的克隆.方法提取微小隐孢子虫总RNA、mRNA,逆转录合成cDNA.将cDNA与pUC18 DNA连接,导入DH5α宿主细胞中生成cDNA文库.根据文献分别设计并合成两对PCR引物,从上述文库中筛选保护性基因,对PCR产物克隆、测序.结果文库容量为1.9×106个重组子,文库中cDNA插入片段大小介于0.4×103～6.5×103 bp.从该文库中克隆出编码23 kDa、15/60 kDa子孢子表面蛋白的核苷酸序列.结论成功地用pUC18质粒载体构建了C.parvum cDNA文库.

瑞香素抗红外期疟原虫作用的研究

目的研究瑞香素(DPNT)抗红外期疟原虫的作用.方法于ICR小鼠腹腔注射约氏疟原虫子孢子后0.5 h灌胃给药,连续4 d.不同剂量的DPNT及DPNT伍用伯氨喹(PQ)的抗疟作用,分别以d7ICR小鼠阴性率及d11或d12ICR小鼠每千个红细胞被原虫感染数作评价,并观察DPNT对ICR小鼠血红蛋白浓度的影响.结果 DPNT的剂量范围为每天10～100 mg/kg,连服4 d,d7原虫阴性小鼠数及d11红细胞被感染程度与对照组相比其差异均无显著性;DPNT每天50 mg/kg和每天PQ5 mg/kg配伍组的d7小鼠阴性率与PQ每天10 mg/kg组相当.ICR小鼠DPNT每天50 mg/kg组与对照组血红蛋白浓度在d7天有差异.结论 DPNT单独用药,无明显抗红外期疟原虫作用,但DPNT每天50 mg/kg与PQ每天5 mg/kg伍用的抗疟效果与PQ每天10 mg/kg相当.DPNT在短期内可致小鼠贫血.

抗蚊中肠抗体对斯氏按蚊体内约氏疟原虫卵囊发育的影响

[目的]研究抗斯氏按蚊中肠抗体对约氏疟原虫蚊期的抑制作用.[方法]在感染血中加入抗蚊中肠抗体,羊膜饲蚊,在蚊虫血餐后14 h、9和12 d,分别检查蚊虫中肠动合子、卵囊及唾液腺中子孢子;并观察抗体浓度和蚊虫血餐抗体次数对卵囊的抑制作用.[结果]抗蚊中肠抗体可降低蚊体内卵囊的感染率和子孢子的进腺率,尚可降低动合子的感染度和卵囊指数(P＜0.05):且抗体浓度越高、蚊虫血餐抗体次数越多,卵囊数量越少.[结论]抗蚊中肠抗体对疟原虫的动合子、卵囊发育有抑制作用,但对卵囊的抑制作用明显,抗体的浓度高和维持时间长,抑制作用越明显.

球虫卵囊的分子生物学研究进展

卵囊(oocyst)是球虫[指艾美球虫亚目(Eimeriina)的种类]在有性生殖过程中产生的,通常随粪便排出体外,含有子孢子的卵囊具有感染性,引起家畜、家禽、野生动物和人体的球虫病.形态学方法是虫种鉴定和病原学诊断的常用方法,但在样本量大、卵囊数量少的情况下其具有检出率低、费时费力等缺点.分子生物学和基因诊断学在理论和技术上的发展为虫种鉴定和病原学诊断提供了有用的工具.本文综述了近年来分子生物学在通过卵囊对球虫进行虫种鉴定和球虫病诊断中的研究进展.

堆型艾美球虫子孢子单克隆抗体的制备及鉴定

目的 建立堆型艾美球虫(Eimeria acervulina)子孢子表面抗原的杂交瘤细胞株.方法 使用纯化的堆型艾美球虫子孢子直接免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立细胞株,制备单克隆抗体.用ELISA确定单克隆抗体的交叉反应性、相对亲和力、免疫球蛋白的类型和亚类,并对单克隆抗体进行鉴定.结果 获得4株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中Easp-3G3、Easp-5G10为IgG1类,Easp-3H6为IgG2b类,Easp-5H4为IgG2a类.4株单克隆抗体均能与堆型艾美球虫子孢子的抗原蛋白反应,但仅Easp-5H4能与柔嫩艾美球虫子孢子抗原蛋白反应.Easp-3G3和Easp-5G10与另外2种单克隆抗体的识别位点不同,而Easp-3G3与Easp-5G10、Easp-3H6与Easp-5H4的识别位点相近.结论 制备了4株堆型艾美球虫子孢子单克隆抗体.

恶性疟原虫FCCl/HN株exp-1基因的克隆及序列分析

分泌蛋白1(exported protem l,exp-1)又称环子孢子相关抗原[1].QF116抗原[2]或抗原5.1[3],是23 kDa的恶性疟原虫红内期抗原.在肝期的晚期也有表达[4].exp-1由疟原虫表面分泌.定位到纳虫空泡和感染的红细胞内的膜结构上[5]本文克隆、测定、分析了恶性疟原虫海南株(FCCl/HN)exp-l基因序列,并对FCCl/HN与国外的3D7[5]、Kl6、FC27[1]、FCR3(GenBank Accession No.AF061080)株exp-l基因编码的氨基酸残基序列进行同源性比较.

中缅边境(西段)传疟媒介的初步调查

目的 了解中缅边境(西段)传疟媒介的分布与构成.方法 2008年8～9月,在中缅边境的中国云南省盈江县及其相邻的缅甸昔懂县6个自然村,用诱蚊灯在人房和牛棚共进行20次通宵诱捕.将捕获的蚊虫以传统方法 进行形态学鉴定,然后用复合PCR法鉴别微小按蚊、乌头按蚊和杰普按蚊.同时,抽提部分蚊虫标本总基因组DNA,以巢式PCR方法 检测蚊体内的疟原虫感染情况.结果 共捕获各类蚊虫4 571只,隶属9属50种,其中按蚊属是优势蚊种,占总量的54.32%(2 483/4 571).人房和牛棚的按蚊蚊种构成差异有统计学意义,其中人房以腹簇按蚊、微小按蚊和中华按蚊为主,而牛棚以腹簇按蚊(223只)、环纹按蚊(184只)、迷走按蚊(131只)和杰普按蚊(129只)为主.对比有牛村和无牛村中人房的蚊种构成发现,有牛村的人房以微小按蚊(260只)和腹簇按蚊(49只)为主,而无牛村人房则以腹簇按蚊(481只)和中华按蚊(124只)为主.巢式PCR检测1 075只按蚊,其中9只检出疟原虫阳性,分别为微小按蚊(7/408)、乌头按蚊(1/125)和伪威氏按蚊(1/101).经测序鉴定均为恶性疟原虫感染,目的 条带长204 bp.结论 中缅边境(西段)蚊虫密度高、种类多,在传疟作用中以微小按蚊为重要,乌头按蚊和伪威氏按蚊亦为当地的传播媒介.