首页 > 文献资料
-
利用流式细胞仪计数蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫方法的初探
目的 研究利用流式细胞仪对蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)孢囊和微小隐孢子虫(Crypto sporidium parvum)卵囊的高浓度混合样本进行计数,为“两虫”标准品制备提供技术支撑,以期能降低“两虫”检测试剂成本.方法 利用已知浓度的荧光微球对经免疫荧光染色的“两虫”混合样本进行计数,采用非参数检验中两个相关样本检验方法对流式细胞仪和荧光显微镜计数结果进行统计学分析比较.结果 流式细胞仪方法计数蓝氏贾第鞭毛虫孢囊和微小隐孢子虫卵囊的相对标准偏差(RSD)分别为14.7％和15.2％,比荧光显微镜计数结果的RSD(14.1％和15.1％)稍高.利用Wilcoxon检验得出两种方法对孢囊和卵囊的计数结果差异均无统计学意义(Z=-0.91 8,P=0.359和Z=-0.102,P=0.919).结论 利用流式细胞仪计数高浓度“两虫”混合样本的方法能达到生物学实验要求的精确度,并与荧光显微镜计数方法具有等效性,可弥补荧光显微镜无法直接计数高浓度样本的不足,并为“两虫”标准品的筛选与分装奠定基础.
关键词： 蓝氏贾第鞭毛虫 微小隐孢子虫 流式细胞仪 荧光显微镜 Wilcoxon检验 -
两种机会性寄生原虫——微小隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫基因检测方法的建立
目的 建立两种机会性寄生原虫--微小隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫(贾第虫)基因检测方法.方法 从微小隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫感染者粪便标本内分离纯化卵囊和包囊,提取基因组DNA.根据微小隐孢子虫18S rRNA基因和贾第虫磷酸丙糖异构酶(tim)基因各设计或合成两对特异性引物,采用PCR技术分别对从卵囊和包囊提取的和6种对照DNA样本(日本血吸虫、刚地弓形虫、溶组织内阿米巴、旋毛虫和阴道毛滴虫以及人体血细胞DNA等),以及此二种虫相互间的DNA样本进行检测,以确定该法的特异性和敏感性.方法 建立后,取艾滋病患者粪便标本对之进行检测.结果 从微小隐孢子虫和贾第虫的DNA样本中分别扩增出各自相应基因的500bp和683 bp长度的片段;少可检测出20pg隐孢子虫和0.4pg贾第虫DNA;几种对照DNA样本均不发生交叉反应;受检的30例艾滋病患者粪便标本中,7例显示微小隐孢子虫阳性,未检出贾第虫.结论 建立的基因检测方法,对微小隐孢子虫和贾第虫的检测具有高度的特异性和敏感性,可用于临床艾滋病合并感染的早期诊断和人群流行病学筛查.
关键词： 微小隐孢子虫 蓝氏贾第鞭毛虫 18S rRNA基因 磷酸丙糖异构酶基因 -
微小隐孢子虫P23抗原在重组干酪乳杆菌中的分泌表达及其免疫原性
本实验以微小隐孢子虫 Cryptosporidium parvum 子孢子抗原P23基因和信号肽基因Usp45为材料,构建干酪乳杆菌 Lactobacillus casei 中分泌表达P23蛋白的重组载体pMG-Usp45-P23.在培养物上清和细菌裂解组分中,分别以SDS-PAGE、Western blotting、IFAT和ELISA等不同方法检测P23蛋白的分泌和表达情况,并用已获得的P23蛋白分泌产物体外刺激Wistar大鼠淋巴细胞,评价其淋巴细胞转化活性.结果表明,分别在细菌培养物上清和破碎菌体组分中检测到大小约为20 kDa(不含信号肽)和23 kDa (含信号肽)的P23蛋白分泌和表达产物.并且该P23蛋白分泌产物与ConA相当,具有显著的淋巴细胞转化活性.本实验为进一步研制动物微小隐孢子虫 C.parvum 活菌疫苗载体的构建奠定了基础.
-
微小隐孢子虫Cpgp40/15基因DNA疫苗表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达
将微小隐孢子虫Cpgp40/15基因定向克隆到真核表达载体pVAX1中多克隆位点XbaⅠ和PstⅠ之间,经酶切鉴定,构建真核表达重组质粒pVAX1-Cpgp40/15,用脂质体介导法将其转染Hela细胞,并用G418加压筛选,后经SDS-PAGE和Western blot方法检测外源基因Cpgp40/15的表达情况,得到预期大小的蛋白带,表明该重组质粒能够在哺乳动物细胞中较好地表达.
关键词： 微小隐孢子虫 Cpgp40/15基因 DNA疫苗 -
微小隐孢子虫的基因检测实验研究
目的探讨聚合酶链反应(PCR)检测微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)感染的特异性和敏感性. 方法用Sheather's蔗糖梯度离心法从微小隐孢子虫感染者粪便标本中分离纯化卵囊.用酚-氯仿法抽提卵囊总DNA.针对本虫18S rRNA基因片段设计1对引物,对模板DNA进行PCR扩增,同时以蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)和旋毛虫(Trichinella spiralis),以及人体血细胞等DNA样本为对照.用琼脂糖电泳和溴乙腚染色对PCR产物进行检测. 结果仅微小隐孢子虫DNA被扩增出一 500 bp的DNA片段.其它对照DNA样本均未出现扩增反应. 结论 PCR对隐孢子虫检测的特异性可高达100%,敏感性也很强,可检测到20 pg微小隐孢子虫卵囊的DNA.表明本实验建立的检测微小隐孢子虫的PCR方法有效.
关键词： 微小隐孢子虫 聚合酶链反应(PCR) 18S rRNA基因 -
微小隐孢子虫卵囊扩增及其纯化方法筛选
目的 扩增微小隐孢子虫卵囊并筛选其纯化方法,以期获得大量有活性的纯净微小隐孢子虫卵囊. 方法 将微小隐孢子虫分离株人工感染犊牛,分别采用饱和蔗糖溶液漂浮法、饱和盐水漂浮法、饱和硫酸锌漂浮法浓集粪便中的卵囊,经氯化铯密度离心纯化后,用脱囊率进行纯化卵囊的活力检测. 结果 3种卵囊浓集方法中,饱和食盐水漂浮法所获得的卵囊杂质少,显微镜下视野干净,经氯化铯密度离心后获得清晰的卵囊带卵囊量为3.5×108个,其中76％的卵囊保持良好活力. 结论 饱和盐水漂浮再结合氯化铯密度离心获得微小隐孢子虫卵囊纯度高、活性良好,可作为实验室批量分离纯化微小隐孢子虫卵囊的首选方案.
-
微小隐孢子虫CP23基因真核表达载体pcDNA3.0-23的构建及鉴定
目的 构建微小隐孢子虫CP23真核表达载体pcDNA3.0-23.方法 提取微小隐孢子虫基因组DNA,PCR扩增CP23基因片段,然后克隆至TA载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将CP23基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA 3.0-23重组质粒.通过PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-23进行鉴定.结果 扩增出约340 bp的微小隐孢子虫CP23基因片段,并成功构建微小隐孢子虫CP23真核表达载体pcDNA3.0-23.结论微小隐孢子虫CP23真核表达载体pcDNA3.0-23的构建为微小隐孢子虫的基因疫苗研制奠定了基础.
-
实验感染昆明鼠粪便微小隐孢子虫18SrRNA基因检测
目的探讨隐孢子虫感染的基因检测方法. 方法用分离自人和牛的微小隐孢子虫各1株分别感染2组昆明小鼠,于接种后第6 d、10 d和14 d分别收集每只动物粪便,用显微镜检查,再用Sheather's蔗糖梯度密度离心法纯化卵囊,提取总DNA,对每份DNA样本做100～10-3稀释,然后用PCR对微小隐孢子虫18SrRNA基因进行特异性扩增.结果接受具有活力的1×104个卵囊/只的36只小鼠,均获得感染;阳性样本被扩增出1条500 bp的片段.隐孢子虫感染小鼠粪便样本各稀释度的PCR检测实验结果表明,PCR检测阳性率随模板DNA样本稀释倍数的增加而增高;小鼠感染后第6 d、10 d和14 d 的100 和10-1两个稀释度的PCR检测阳性率低于镜检结果,而10-2和10-3两个稀释度均高于镜检结果. 结论受染昆明鼠粪便内的微小隐孢子虫可通过扩增其18SrRNA基因检出.
关键词： 微小隐孢子虫 聚合酶链反应(PCR) 18SrRNA基因 昆明小鼠 -
微小隐孢子虫糖蛋白GP900对HCT-8细胞Akt和MAPK通路的影响
目的 探讨微小隐孢子虫糖蛋白GP900对HCT-8细胞Akt和MAPK信号通路的影响,为进一步研究微小隐孢子虫与宿主细胞的相互作用提供理论依据. 方法 以微小隐孢子虫卵囊cDNA为模板,PCR扩增GP900基因片段,同收后连接到pMD-18T载体,构建重组克隆质粒pMD-18T-GP900.双酶切pMD-18T-GP900和pET-32a载体并进行连接,构建pET 32a-GP900重组质粒,双酶切及测序鉴定正确后转化人大肠埃希菌BL21(DE3),重组菌用IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析GP900的表达.采用Ni-NTA亲和层析富集和超滤纯化GP900重组蛋白用Triton-114去除内毒素,直至重组蛋白内毒素含量在0.01～0.1 Eu/mg为止,然后用Hydrophobic beads吸附残留的Triton 114,收集重组蛋白.用GP900重组蛋白刺激HCT 8细胞,收集不同刺激时间的细胞,提取全蛋白,采用Western blot检测Akt、p38和ERK的磷酸化;用不同浓度GP900刺激后检测细胞中上述通路蛋白的磷酸化与GP900剂量的关系. 结果 pET-32a-GP900重组质粒经双酶切及测序鉴定构建正确,表达的重组GP900蛋白分子质量与理论值相符.纯化的重组蛋白刺激HCT-8细胞后,Akt在60 min发生磷酸化且随着GP900浓度增加磷酸化程度呈剂量依赖,p38在60 min发生磷酸化但不呈剂量依赖,ERK在90 min发生磷酸化但不呈剂量依赖. 结论 成功构建了GP900重组质粒,表达的GP900重组蛋白可诱导HCT-8细胞Akt、p38和ERK信号通路活化.
-
以18SrRNA基因为分子标记的微小隐孢子虫系统发育研究
目的 以18SrRNA基因为分子标记对分离自我国人和牛,以及澳大利亚和美国不同宿主来源微小隐孢子虫的系统发育进行探讨.方法 用PCR扩增我国两个虫株的18SrRNA基因片段并进行序列测定,与登录于GenBank的澳、美两国虫株的相应序列进行比对.用M法构建分子系统树进行系统发育分析.结果 分离自我国的小牛虫株(JLC)与GenBank中3个牛源虫株(澳大利亚的C1,美国的UCP和AUCP-1)亲缘关系近,位于系统发育树的同一枝;分离自我国的人源虫株(JSH)与澳大利亚鼠源虫株(M24)同源,共同位于系统发育树的另一枝.结论 本研究中微小隐孢子虫株间亲缘关系的远近似主要由宿主因素决定,而受地理位置的影响较小.
-
基于SYBR Green检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR方法的建立及应用
目的 建立一种方便快捷的检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法.方法 根据GenBank公布的微小隐孢子虫18s rRNA基因序列设计1对引物,通过质粒DNA和卵囊检测标准曲线的绘制及特异性和重复性的研究,建立检测微小隐孢子虫的基于SYBR Green的Real-time PCR方法,进而对奶牛粪便进行检测.结果 建立的Real-time PCR法对检测微小隐孢子虫具有很高的特异性,质粒DNA和卵囊的检测阈值分别达到1个拷贝和10个卵囊,奶牛粪便阳性率为25.93%(21/81),高于普通PCR检测率20.99%(17/80).结论 建立的Real-time PCR方法简便、快速,特异性强,敏感度高,可用于微小隐孢子虫的快速定量检测.
关键词： 实时荧光定量PCR SYBR Green 微小隐孢子虫 检测 18S rRNA -
微小隐孢子虫表面抗原CP23基因的克隆及表达
目的构建微小隐孢子虫表面抗原CP23基因表达载体并获得重组表达蛋白. 方法用微小隐孢子虫卵囊感染免疫抑制BALB/c小鼠,用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化微小隐孢子虫卵囊,用酚-氯仿抽提法提取微小隐孢子虫基因组DNA,PCR扩增CP23基因片段,然后克隆至TA载体;通过酶切、测序鉴定后,将CP23基因片段用限制性内切酶切下克隆至pET-30a(+)载体,构建pET-30a-23质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定. 结果扩增出约340 bp的微小隐孢子虫CP23基因片段并成功构建pET-30a-23质粒,表达出分子质量单位为27 ku的融合蛋白,Western blot显示该蛋白能被抗微小隐孢子虫血清识别. 结论成功构建pET-30a-23质粒,表达产物具有免疫反应性,为微小隐孢子虫的免疫学诊断及疫苗研制打下了基础.
关键词： 微小隐孢子虫 CP23基因 克隆 表达 Western blot -
抗微小隐孢子虫TSP6蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
目的 在大肠埃希菌中可溶性表达微小隐孢子虫TSP6抗原分子,并以其纯化产物为抗原,利用杂交瘤技术生产抗TSP6单克隆抗体(McAb). 方法 将pGEX-4T-1-TSP6重组质粒转化大肠埃希菌BL21 (DE3),经0.1 mmol/LIPTG诱导表达后超声破菌,获得可溶性表达产物,通过Gluthathione-Sepharose 4B磁珠纯化蛋白质,以纯化的重组TSP6为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行细胞融合,用ELISA和有限稀释法筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及效价,Western blot分析其特异性. 结果 筛选出2株杂交瘤细胞能稳定分泌抗TSP6单克隆抗体,经鉴定均为IgG1.Western blot分析显示,制备的单抗均能与相应的重组蛋白特异性结合. 结论 制备的抗TSP6杂交瘤细胞株能分泌高特异性的McAb.
-
聚合酶链反应检测隐孢子虫的临床应用探讨
目的 探讨一种更为简便的聚合酶链反应（PCR ）检测人体微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum, C.p.）的模板制备方法。 方法 根据Laxer MA等克隆的C.p.核酸序列片段设计并合成一对引物，将含有C.p.卵囊的粪便经浓集、裂解后，直接取上清液作为模板与引物进行PCR反应。 结果 取自于桂林、福州和徐州三地含有C.p.的粪便标本均能扩增出418 bp的C.p.目的DNA条带，阴性对照无扩增。 结论 应用该引物对人粪便中的C.p.进行PCR检测具有高度特异性,该模板制备方法能缩短PCR检测C.p.时间，较适于临床实际应用。
-
隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR-RFLP分析
目的建立用巢式聚合酶链反应(Nested PCR)- 限制片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)检测、鉴别微小隐孢子虫(Cryptospordium parvum)和安氏隐孢子虫(C. andersoni)的方法. 方法用巢式PCR技术扩增长春市人和牛粪便中C. parvum与C. andersoni的Small-Subunit rRNA (SSU rRNA)部分基因,并克隆和测序.扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切,进行RFLP分析,并与GenBank上的17株隐孢子虫相应序列进行对比分析和系统发育分析. 结果 C. parvum HCC1、C. parvum BOCC1和C. andersoni BOCC1扩增产物片段大小分别为830 bp、830 bp和828 bp,经SspⅠ和VspⅠ分别单酶切后形成2种不同的RFLP图谱,根据RFLP图谱可鉴别C. parvum与C. andersoni.序列分析结果显示,C. parvum HCC1与国外牛源C. parvum BOH6、C. parvum GCH1、鹿源C. parvum DR1相应序列同源性均为99.3%;C. parvum BOCC1与国外牛源C. parvum BOH6、C. parvum GCH1、鹿源C. parvum DR1相应序列同源性均为99.5%;C. andersoni BOCC1与国外C. andersoni相应序列同源性为99.9%.系统发育分析结果显示,隐孢子虫虫种形成了2个群,1个群包括C. parvum、C. baileyi、C. meleagridis、C. felis和C. wrairi,另1个群包括C. andersoni、C. muris和C. serpentis. 结论用巢式PCR技术可扩增隐孢子虫基因组DNA中特异片段,根据RFLP图谱可鉴别C. parvum和C. andersoni,表明本实验建立的检测、鉴别C. parvum和C. andersoni的巢式PCR- RFLP方法有效,为我国隐孢子虫分类、隐孢子虫病的分子流行病学研究和诊断打下了良好基础.
-
TLR2对微小隐孢子虫刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子的影响
目的 研究微小隐孢子虫刺激对小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子分泌的影响,以及TLR2在微小隐孢子虫刺激小鼠腹腔巨噬细胞中的作用. 方法 用微小隐孢子虫子孢子刺激野生型(WT)小鼠腹腔巨噬细胞8h,并设置不加任何物质对照组.收取细胞培养上清,采用ELISA法检测IL-6、IL-10、IL 12和TNF-α水平.其次,将微小隐孢子虫子孢子分别与WT小鼠腹腔巨噬细胞和TLR2-/-小鼠腹腔巨噬细胞共培养,收取2、4、8h细胞培养上清,采用ELISA法检测IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α水平并进行比较,分析TLR2对微小隐孢子虫刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子的影响.结果 微小隐孢子虫子孢子刺激WT小鼠腹腔巨噬细胞IL-6(t=10.34)、IL-10(t=55.10)、IL-12(t=10.91)、TNF-α(t=11.078)水平较对照组显著升高(P＜0.01);微小隐孢子虫子孢子刺激TLR2-/-小鼠腹腔巨噬细胞与WT小鼠比较IL-6(t8hr=4.299)显著下调(P＜0.01),IL-10(t8hr=8.858)和IL-12(t4hr=7.329,t8hr=17.479)显著上调(P＜0.01),TNF-α水平差异无统计学意义. 结论 微小隐孢子虫可以诱导小鼠腹腔巨噬细胞IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α分泌水平增高,而TLR2对微小隐孢子虫刺激小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子分泌具有调节作用.
-
微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫Rhomboid基因部分序列的克隆和分析
目的 获得我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因(CPRho和CARho)部分序列并确定与国外分离株相应序列的同源性.方法 应用RT-PCR技术扩增微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因片段,然后将其克隆到pMD18-T载体中,测得序列应用DNAMAN软件进行序列分析.结果 经RT-PCR扩增出微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,大小均为723 bp.经DNA MAN软件分析,表明我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid核苷酸序列同源性为99.6%,氨基酸同源性为99.2%.二者与GenBank公布的相应序列核苷酸同源性分别为99.9%和99.7%,而氨基酸同源性均为99.6%.结论 获得了微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,为继续研究该基因的侵入功能等奠定了基础.
关键词： 微小隐孢子虫 安氏隐孢子虫 Rhomboid基因 克隆 -
Caco-2细胞TLR2和TLR4对微小隐孢子虫刺激信号的识别
目的 研究Caco-2细胞在微小隐孢子虫感染后TLRs的激活情况.方法 微小隐孢子虫子孢子刺激Caco-2细胞后,通过qRT-PCR检测TLRs mRNA的表达水平,采用Western blot检测NF-κB激活情况,采用ELISA检测IL-8的分泌量.同时,在微小隐孢子虫子孢子感染Caco-2细胞前加入TLR2或TLR4的抑制剂,检测NF-κB激活情况以及IL-8的分泌情况.结果 将Caco-2细胞感染微小隐孢子虫子孢子2h后,提取的RNA反转成cDNA,采用普通PCR进行检测,结果表明Caco-2能够表达所有10种人TLRs;qRT-PCR检测刺激组与对照组TLRs表达量,经spss分析,p＜0.01,刺激组TLR2和TLR4的表达量较对照组显著上调.对Caco-2细胞感染微小隐孢子虫子孢子1h后提取的细胞全蛋白进行Western blot,显示NF-κB激活水平较对照组显著上调;Caco-2细胞感染微小隐孢子虫子孢子12h后收集的细胞培养上清经ELISA检测,IL-8分泌量由刺激前的65.23 pg/ml显著上调至488.23 pg/ml.而在微小隐孢子虫子孢子感染Caco-2细胞前加入TLR2或TLR4的抑制剂,NF-κB激活水平和IL-8的分泌量较未加抑制剂感染组均显著下调,IL-8的分泌量分别降至204.02 pg/ml(抑制TLR2活性后)和142.79 pg/ml(抑制TLR4活性后).结论 Caco-2细胞的TLR2和TLR4参与对微小隐孢子虫子孢子的识别.
-
微小隐孢子虫感染动物模型及其应用研究进展
微小隐孢子虫是近年来导致人和动物水样腹泻的重要寄生原虫之一, 并且至今尚无有效的防控药物和疫苗, 严重威胁着公共卫生安全和畜牧业的健康发展.建立微小隐孢子虫感染动物模型对研究其致病机理、免疫机制、药物防控等均有重要意义.本文综述了近年来报道的国内外感染动物模型及其应用, 以期为防控人畜共患隐孢子虫病提供重要参考.
-
人体隐孢子虫的实验室检测
隐孢子虫(Cryptoridium Tyzzer)是一种可引起人和动物腹泻的肠道原虫.本虫于1907年由Tyzzer首次从无症状的鼠类胃粘膜中检出,并命名为鼠隐孢子虫(C.muris);1976年Meisel等[1]首次报告了美国的2例人体隐孢子虫病例,本虫因此而受到医学界重视.我国人体隐孢子虫病由韩范等1987年在南京首次报道[2].自1981年第1例获得性免疫缺陷综合症(AIDS)患者在美国报道后,本虫即被确认为艾滋病患者合并感染的重要机会性致病病原之一,并被列为艾滋病患者的常规检查项目.迄今已知导致隐孢子虫病的病原体共有6种,其中只有微小隐孢子虫(C.parvum)寄生于人体,且具有致病力.
