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两种机会性寄生原虫——微小隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫基因检测方法的建立
目的 建立两种机会性寄生原虫--微小隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫(贾第虫)基因检测方法.方法 从微小隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫感染者粪便标本内分离纯化卵囊和包囊,提取基因组DNA.根据微小隐孢子虫18S rRNA基因和贾第虫磷酸丙糖异构酶(tim)基因各设计或合成两对特异性引物,采用PCR技术分别对从卵囊和包囊提取的和6种对照DNA样本(日本血吸虫、刚地弓形虫、溶组织内阿米巴、旋毛虫和阴道毛滴虫以及人体血细胞DNA等),以及此二种虫相互间的DNA样本进行检测,以确定该法的特异性和敏感性.方法 建立后,取艾滋病患者粪便标本对之进行检测.结果 从微小隐孢子虫和贾第虫的DNA样本中分别扩增出各自相应基因的500bp和683 bp长度的片段;少可检测出20pg隐孢子虫和0.4pg贾第虫DNA;几种对照DNA样本均不发生交叉反应;受检的30例艾滋病患者粪便标本中,7例显示微小隐孢子虫阳性,未检出贾第虫.结论 建立的基因检测方法,对微小隐孢子虫和贾第虫的检测具有高度的特异性和敏感性,可用于临床艾滋病合并感染的早期诊断和人群流行病学筛查.
关键词： 微小隐孢子虫 蓝氏贾第鞭毛虫 18S rRNA基因 磷酸丙糖异构酶基因 -
塞隆骨原动物高原鼢鼠核基因18S rRNA序列测定与分析
目的：测定仓鼠科动物高原鼢鼠Myospalax b aileyi的核rDNA基因序列，为塞隆骨正品基原检定提供分子依据。方法：采用PCR直接测序技术测定高原鼢鼠18S rRNA基因核苷酸序列并作序列特征分析。[ HT5”H〗结果：高原鼢鼠的18S rRNA序列长度为1 851 bp。根据排序比较，高原鼢鼠与2种鼠科动物间的DNA序列同源性 为72.04%～72.18%。结论：通过基因序列分析，DNA测序技术可成为 塞隆骨正品基原检定的准确有效手段。
关键词： 塞隆骨 高原鼢鼠 18S rRNA基因 DNA测序 -
北京市房山区羊梨形虫病流行病学调查
为了解北京郊区羊梨形虫病的流行情况,本研究采用形态学检测,同时结合使用梨形虫18S rRNA基因通用引物进行PCR与直接测序法,对来自北京市房山郊区某养殖场的120只山羊及15只绵羊全血样本进行检测.结果发现血涂片中梨形虫检测阳性率为95.0％,其中吕氏泰勒虫Theileria luwenshuni于山羊中检出115例阳性,阳性率95.8％;于绵羊中检出6只阳性;未发现其他泰勒虫以及巴贝斯虫的感染.本研究首次对北京周边地区进行羊梨形虫分子流行病学研究,发现房山地区为吕氏泰勒虫流行区,并且发现山羊对吕氏泰勒虫可呈现长期带虫感染.
关键词： 羊梨形虫病 羊泰勒虫病 吕氏泰勒虫 流行病学调查 18S rRNA基因 -
哈尔滨市污水处理厂原水中安氏隐孢子虫的分子鉴定
目的 对哈尔滨市污水处理厂原水中隐孢子虫进行分子鉴定.方法 提取污水处理厂原水中的隐孢子虫基因组DNA,对其18S rRNA基因进行巢式PCR扩增,通过序列分析确定隐孢子虫虫种,并与GenBank的参考序列进行同源性分析.结果 从哈尔滨市污水处理厂原水中分离鉴定出安氏隐孢子虫,该虫株18S rRNA基因序列与文献报道的安氏隐孢子虫序列(EU926592)同源性为100%.结论 哈尔滨市污水处理厂原水中存在安氏隐孢子虫,对当地畜牧业的发展构成严重威胁,但对当地人群危害较小.
关键词： 隐孢子虫 污水 18S rRNA基因 分子鉴定 -
微小隐孢子虫的基因检测实验研究
目的探讨聚合酶链反应(PCR)检测微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)感染的特异性和敏感性. 方法用Sheather's蔗糖梯度离心法从微小隐孢子虫感染者粪便标本中分离纯化卵囊.用酚-氯仿法抽提卵囊总DNA.针对本虫18S rRNA基因片段设计1对引物,对模板DNA进行PCR扩增,同时以蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)和旋毛虫(Trichinella spiralis),以及人体血细胞等DNA样本为对照.用琼脂糖电泳和溴乙腚染色对PCR产物进行检测. 结果仅微小隐孢子虫DNA被扩增出一 500 bp的DNA片段.其它对照DNA样本均未出现扩增反应. 结论 PCR对隐孢子虫检测的特异性可高达100%,敏感性也很强,可检测到20 pg微小隐孢子虫卵囊的DNA.表明本实验建立的检测微小隐孢子虫的PCR方法有效.
关键词： 微小隐孢子虫 聚合酶链反应(PCR) 18S rRNA基因 -
环介导等温扩增检测恶性疟原虫的应用研究
目的 探讨环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测恶性疟患者血中疟原虫的敏感性和特异性.方法 收集恶性疟患者和健康人血液样品,分别用LAMP、镜检法和巢式PCR检测恶性疟原虫,计算LAMP的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值,并与巢式PCR进行比较.结果 共检测78份恶性疟患者和30份健康人血样,其中72份患者血样LAMP检测为阳性,以镜检法为金标准,LAMP筛检的灵敏度为92.3%,特异度为100%,阳性预测值和阴性预测值分别为100%和83.3%;以巢式PCR为参考,LAMP筛检的灵敏度为97.2%,特异度为94.4%.结论 LAMP方法检测恶性疟原虫的敏感度和特异度与巢式PCR方法相近,可应用于现场恶性疟检测.
关键词： 环介导等温扩增反应 疟原虫 恶性 18S rRNA基因 -
应用LAMP技术对4种疟原虫进行属种鉴定的初步研究
目的 建立对4种感染人的疟原虫虫属及定量的环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)基因检测方法.方法 根据恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、间日疟原虫的18S rRNA基因共有保守序列及LAMP技术原理,设计一套含有6条疟原虫虫属特异性引物的LAMP反应体系,产物经SYBR Green Ⅰ进行显色反应及电泳分析,观察其特征条带的情况,利用LAMP技术检测上述4种疟原虫DNA及其它12种相关寄生虫DNA评价反应特异性,利用PCR技术为参照对LAMP技术检测疟原虫虫属试验的敏感性,利用疟原虫重组质粒探索建立疟原虫LAMP定量的可能性.结果 4种疟原虫LAMP产物经显色后呈绿色,经电泳后呈特征性梯状条带,阴性对照及其它相关寄生虫DNA无明显扩增,重组质粒浓度在1.42×104～1.42×109拷贝/μl范围内时,反应循环阈值与模板浓度有良好的线性关系(r=0.9995).与PCR方法相比较,建立的疟原虫虫属LAMP检测方法的敏感性是其10倍,检出限达到1.42×101拷贝/μl.结论 建立的检测疟原虫属种、数量的LAMP方法具有较高的特异性和敏感性,适合疟疾防治检测的需要.
关键词： 环介导等温扩增技术 属种 疟原虫 18S rRNA基因 -
广藿香与土藿香的DNA序列分析及其分子鉴别
目前市场上藿香类商品药材有两种,一种为唇形科刺蕊草属(Pogostemon)植物广藿香Pogostemon cablin (Blanco) Benth.的干燥地上部分,主产广东、海南,习称"广藿香",均为栽培品,有芳香化浊、开胃止呕、发表解暑的功效,是中成药"藿香正气水"的主要原料.
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隐孢子虫卵囊基因组的提取及以保守基因为靶标的PCR检测
目的 探讨提高PCR检测微小隐孢子虫卵囊方法 的特异性和敏感性,为防止隐孢子虫病流行提供检测依据.方法 应用BALB/c小鼠感染扩增卵囊,不连续蔗糖密度梯度离心法从粪便中纯化卵囊,通过冻融和超声法破碎卵囊,然后以酚/氯仿/异戊醇法提取基因组DNA作为PCR扩增模板,根据隐孢子虫保守基因18S rRNA,设计一对特异性的引物,扩增约450 bp的目的 片段.结果 超声处理法对隐孢子虫卵囊的破囊率为92%,明显高于冻融法的86%.2个组抽提的DNA作为模板均扩增出目的 片段,但超声处理组敏感性高于冻融处理组,分别能检测到卵囊2个/mL和20个/mL.结论 超声法对微小隐孢子虫卵囊的破碎效果优于冻融法,经改进的PCR检测微小隐孢子虫卵囊方法 具有特异性好和敏感性强的特点.
关键词： 隐孢子虫卵囊 基因组提取 18S rRNA基因 PCR -
基因测序技术在中药质量研究中的应用(Ⅱ)——山药基原的DNA测序鉴别
目的分析正品山药Dioscorea polystachya Turcz.与地方习用品广山药D.persimilis Prain et Burkill、土山药D.japaonica Thunb.和方山药D.alata L.的核基因组18S rRNA基因序列,为山药基原鉴别及品质评价提供分子依据.方法采用PCR直接测序技术测定山药及其地方习用品的18S rRNA基因核苷酸序列并作序列同源性分析.结果山药、广山药和土山药的18S rRNA序列长度均为1 810 bp,而方山药为1 807 bp.根据排序比较,广山药与正品山药的18S rRNA序列完全相同,而与土山药和方山药的序列同源性分别为99.89%和97.51%.结论 DNA测序技术可成为山药基原鉴定准确而有效的分子方法.
关键词： 山药 18S rRNA基因 DNA测序 基原鉴别 -
云南省边境地区疟原虫18S rRNA基因种类鉴定与序列分析
目的 使用基于18S rRNA基因的巢式PCR方法对云南省边境地区镜检为恶性疟和间日疟的患者血样进行鉴定,分析该地区疟原虫18S rRNA基因序列之间的差异. 方法 2004-2011年在云南省边境地区西双版纳勐腊、保山腾冲和德宏盈江,及缅甸那威、南卡江、芒东和拉咱等7个县(市)收集镜检为单一感染恶性疟原虫或间日疟原虫的全血或滤纸血样品.采用基于18S rRNA基因的巢式PCR方法对所有血样进行鉴定,阳性PCR产物进行测序.所获序列进行Blastn比对.应用MEGA 6.06软件采用邻接法构建系统进化树. 结果 475份镜检为恶性疟原虫(256份)和间日疟原虫(219份)感染的血样中,经18S rRNA基因检测为恶性疟原虫感染的有242例,间日疟原虫感染176例和混合感染57例.镜检法和巢式PCR法检测结果一致的血样占81.7％(388/475).两法检测不一致的血样发生频率与其原虫密度显著相关(Spearman's r=-0.408,P＜0.05).多序列比对分析结果显示,共计得到11条、10条恶性疟原虫、间日疟原虫18S rRNA基因同源序列,变异位点分别占2.9％ (6/205)和22.5％ (27/120).所获恶性疟原虫18S rRNA基因序列与来自喀麦隆(GenBank登录号KC428742)等基因序列聚在一个大的分支,与来自荷兰和巴西的3个恶性疟原虫S型18S rRNA基因序列(GenBank登录号U36465、U36466和U36467)的亲缘关系较远.所获间日疟原虫序列与来自泰国的间日疟原虫A型小亚单位核糖体核糖核酸(SSU rRNA)基因序列(GenBank登录号U07367)等聚在一支,与来自泰国的间日疟原虫C型基因序列(GenBank登录号U07368)等参考序列亲缘关系较远. 结论 镜检为单一感染的血样中,巢式PCR检出 57例混合感染.云南省边境地区7个县(市)疟原虫18S rRNA基因序列之间无明显差异.
关键词： 恶性疟原虫 间日疟原虫 18S rRNA基因 巢式PCR 聚类分析 -
念珠菌PCR检测技术的初步探讨
念珠菌18S rRNA基因区为念珠菌共有的保守区,我们在此基因区设计了一对寡核苷酸引物,建立了念珠菌的PCR检测方法,现介绍如下.
关键词： 18S rRNA基因 聚合酶链反应 念珠菌 -
18S rRNA基因巢式PCR-RFLP分析两株牛源隐孢子虫分离株
目的 18S rRNA巢式聚合酶链反应(Nested PCR)-限制片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)鉴定上海(简称SH-BOV)和徐州(简称XZ-BOV)两株牛源隐孢子虫.方法 改良-抗酸染色确定感染隐孢子虫的上海株和徐州株牛粪,提取DNA后经18S rRNA基因巢式PCR扩增,扩增产物测序后用Blast和MEGA软件进行同源性和系统发育分析.同时扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切,且XZ-BOV扩增产物用DdeⅠ酶切后进行RFLP分析.结果 通过18S rRNA基因分析,SH-BOV与1株巴西牛隐孢子虫Cryptospridium bovis同源性为100%,种系发育树上两者在同一分支;XZ-BOV与安氏隐孢子虫C. andersoni同源性为99%,种系发育树上两者在同一分支.扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切后,可鉴别出SH-BOV为C. bovis,XZ-BOV为C. andersoni或C. muris.XZ-BOV扩增产物用DdeⅠ酶切后可鉴别出XZ-BOV为C. andersoni.结论 上海株牛源隐孢子虫(SH-BOV)鉴定为牛隐孢子虫(C. bovis),徐州株牛源隐孢子虫(XZ-BOV)鉴定为安氏隐孢子虫(C. andersoni).
关键词： 牛隐孢子虫 安氏隐孢子虫 18S rRNA基因 巢式 PCR-RFLP
