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多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌
目的 建立改良分子信标-多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法,应用于食源性致病菌的快速诊断.方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因,分别设计一对引物和改良分子信标探针,用同色荧光标记,用于同体系检测沙门菌.志贺菌根据ipaH基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,加入沙门菌检测体系中,建立三重实时PCR-改良分子信标检测体系,应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测.结果 改良分子信标-多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69～93fg/μl,菌液灵敏度为32～64 CFU/ml或1～2 CFU/PCR反应体系,无交叉反应.该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰.对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测,569份沙门菌实时PCR阳性,其中551份沙门菌培养阳性;42份志贺菌实时PCR阳性,其中41份志贺菌培养阳性.从样品处理到检测结果仅需时间2 h至1 d.结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断,伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段.
关键词： 沙门菌 志贺菌 多重实时聚合酶链反应 同步检测 -
宫颈癌及癌前病变HPV-16存在状态检测的研究
目的:为建立理想的HPV存在状态检测方法,了解宫颈癌及癌前病变HPV-16 DNA的整合状况,初步探讨HPV-16 DNA整合在宫颈癌发生发展中的作用及HPV-16整合状态检测可能具有的临床应用价值.方法:采用多重实时PCR同管定量检测HPV-16 E2和E6基因,根据E2/E6比值来判定HPV-16 DNA的存在状态;并对HPV-16阳性的51例宫颈鳞癌和49例宫颈上皮内瘤样病变石蜡标本进行检测.结果:1)HPV-16 E2、E6标准曲线相关系数均为1.00,扩增效率均在95%以上.2)确定0.81作为多重实时PCR区分游离型和混合型HPV-16的界值.3)CIN Ⅰ中HPV-16大多以游离方式存在,但仍有整合的发生(42.9%);CINⅡ和CINⅢ中HPV-16以混合型为主;浸润癌中以整合型HPV-16为主.4)HPV-16整合发生率与不同程度的宫颈病变有关,并且随着宫颈病变级别的升高HPV-16整合发生率呈上升趋势.5)Ⅱ+Ⅲ期宫颈癌中整合型HPV-16所占比例显著高于Ⅰ期宫颈癌.结论:1)多重实时定量PCR是一种敏感性高、简便快速的HPV-16病毒存在状态的检测方法.2)HPV-16整合是宫颈癌变的早期事件,与宫颈癌前病变的进展有关.3)宫颈癌中整合型HPV-16的发生可能具有预后价值.
关键词： 人乳头瘤病毒16 多重实时聚合酶链反应 整合 宫颈癌 -
多重实时PCR对宫颈癌及癌前病变HPV-16病毒整合状态的检测
目的:探讨检测HPV存在状态的理想方法,了解HPV-16整合在宫颈癌发生发展中的作用及其可能的临床应用价值.方法:用多重实时PCR同管定量检测HPV-16的E2和E6基因,根据E2/E6判定HPV-16的存在状态;与Southern杂交检测结果进行比较.检测HPV-16阳性的宫颈鳞癌51例和宫颈上皮内瘤病变49例的石蜡标本.结果:(1)多重实时PCR所得HPV-16 E2、E6标准曲线的相关性好,扩增效率均高于95%;(2)确定多重实时PCR以E2/E6比值为0.81作为区分游离型和混合型HPV-16的界值;(3)多重实时PCR与Southern杂交检测的符合率为81.5%(Kappa值为0.844,P＜0.001);(4)HPV-16整合发生率与不同程度的宫颈病变有关,CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和SCC中HPV-16整合发生率分别为42.9%、76.5%、83.3%和90.2%;(5)Ⅱ+Ⅲ期宫颈癌中整合型HPV-16所占比例(88.0%)显著高于Ⅰ期宫颈癌(33.3%).结论:多重实时定量PCR是检测HPV-16病毒存在状态的可靠方法,有准确、省时、简便快速及高通量的优点.
关键词： 人乳头瘤病毒16 多重实时聚合酶链反应 整合 宫颈肿瘤 -
多重实时PCR对宫颈癌组织及SiHa细胞株HPV-16病毒存在状态的检测
背景与目的:人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染与宫颈癌发生发展密切相关,高危型HPV病毒整合入宿主细胞是细胞转化及癌变的关键.病毒整合状态的检测对深入探讨宫颈癌发生发展机制及预测宫颈病变的转归有一定的临床意义.然而目前尚没有一种理想的能够用于各种临床标本的HPV存在状态的检测方法.本研究旨在探讨HPV-16存在状态的理想检测方法.方法:以HPV-16质粒为标准品,利用两种不同的荧光报告基团,采用多重实时PCR同管定量检测HPV-16 E2和E6基因,根据E2和E6基因拷贝数的比值(E2/E6)来判定HPV-16的存在状态;对HPV-16阳性的宫颈癌SiHa细胞和27例宫颈鳞癌新鲜标本进行多重实时PCR与Southern杂交检测,将两种检测方法的结果进行比较.结果:(1)多重实时PCR所得到的HPV-16 E2、E6标准曲线相关性好,相关系数均为1.00,扩增效率均在95%以上.(2)对系列稀释的HPV-16质粒进行重复检测,确定了E2/E6比值为1时该多重实时PCR检测系统的95%参考值范围为0.81～1.29,以0.81作为区分游离型和混合型HPV-16的界值.(3)多重实时PCR与Southern杂交检测均发现SiHa细胞中HPV-16呈整合型,27例鳞癌中22例获得了一致的检测结果,符合率为81.5%,Kappa值为0.844,P＜0.001.结论:多重实时定量PCR是一种可靠的、便于临床应用的检测HPV-16病毒存在状态的方法,具有省时、简便快速、高通量的优点,并且能用于石蜡切片以及病灶较小、DNA含量少的宫颈癌前病变组织或宫颈细胞学标本.
