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艾美耳球虫子孢子从宿主细胞中逸出机制的初步研究
艾美耳球虫是一类重要的肠道病原，其裂殖生殖阶段的虫体逸出过程是造成畜禽肠道破坏的主要原因之一，但此逸出过程的机制仍鲜有报道。本研究以乙醇作为诱导剂研究柔嫩艾美耳球虫M2 e株子孢子从宿主细胞中逸出的机制。结果显示，乙醇可诱导子孢子从MDBK细胞中逸出，此逸出过程依赖于虫体的运动能力；同时，乙醇可激发子孢子逸出相关的微线体蛋白2（ Mic2）的分泌释放。进一步实验证实，螯合虫体内部钙离子明显阻断了子孢子逸出及Mic2蛋白的释放。本研究初步证实了与柔嫩艾美耳球虫逸出相关的蛋白和离子，为深入解析球虫致病的分子机制、研发新型抗球虫药物提供了新的研究方向。
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柔嫩艾美耳球虫田间分离株对马杜霉素耐药性检测
以对马杜霉素完全敏感和柔嫩艾美耳球虫豪顿株为参照,检测柔嫩艾美耳球虫2个河北分离株(HBZ、HBH)、2个山东分离株(SDZ、SDT)对马杜霉素的耐药程度.按每羽5×10 4个孢子化卵囊的剂量接种7日龄试验鸡只,接种后第7天剖杀所有试验鸡,观察盲肠病变,计算平均增重、盲肠内容物卵囊数、粪便中卵囊排出量和抗球虫指数(ACI).以ACI值作为判定耐药程度的标准,ACI≥180判为敏感,160≤ACI<180判为部分耐药,ACI<160判为耐药.结果是柔嫩艾美耳球虫豪顿株的ACI为198.3,柔嫩艾美耳球虫河北分离株HBZ、HBH组的ACI分别是147.5、153.7,山东分离株SDZ、SDT组的ACI分别是127.2、130.0.试验证明柔嫩艾美耳球虫2个河北分离株(HBZ、HBH)、2个山东分离株(SDZ、SDT)对马杜霉素具有耐药性.
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柔嫩艾美耳球虫山西分离株的分离与致病性观察
运用单卵囊分离技术,从山西省某鸡场鸡球虫感染粪便样品中获得1株纯种球虫,鉴定为柔嫩艾美耳球虫并命名为Eimeria tenella SX010323,并对其致病性进行了研究.(1)该球虫卵囊寄生于盲肠、为宽卵圆形,卵囊壁光滑、褐色,无卵膜孔,有极粒,无内、外残体.孢子囊呈长卵圆形,有斯氏体.卵囊大小范围为(16.80～28.80)μm×(14.40～25.20)μm,平均大小为(21.54±0.24)μm ×(17.85±0.24)μm,形状指数为1.21±0.05.子孢子,大小范围为(10.20～12.75)μm×(4.40～7.25)μm,平均大小为(11.54±0.24)μm×(6.27±0.43)μm.潜隐期为141 h,短孢子化时间为19 h;(2)63只11日龄的海兰白公雏随机分为7组,分别口服感染此新鲜卵囊1×10<'3>、5×10<'3>、1×10<'4>、2×10<'4>、5×10<'4>、1.0×10<'5>个,并设立不感染对照组.结果表明:所有感染组增重均低于对照组(P<0.05),各感染组间随着感染剂量的增加,增重和增重率显著降低,血便率和盲肠病变记分增加(P<0.05);(3)将4℃分别保存17、13、10、4、1个月和新鲜孢子化的虫株卵囊,以1.5×10<'4>个/只的剂量感染11日龄雏鸡,每组10只.结果表明:保存1个月和4个月活力较高,保存10个月活力开始下降,保存13、17个月活力下降较大.
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鸡柔嫩艾美耳球虫发育相关基因的cDNA阵列检测及分析
为从分子水平上了解球虫发育的相关信息,本文以柔嫩艾美耳球虫的4个发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)为试材,分别与本实验室制备的柔嫩艾美耳球虫cDNA阵列进行杂交.经过分析,在4个不同发育阶段共有484个基因特异表达,其中仅79个为功能注释基因,其余为功能未知基因.在子孢子阶段筛选到了以下重要基因:1.糖代谢相关基因如糖原磷酸化酶、葡萄糖酸透性酶和丙酮酸激酶;2.入侵宿主细胞相关基因如微线蛋白2(MIC2)、黏液素和类黏液素蛋白.信号转导相关基因如磷脂酰激醇4激酶在未孢子化卵囊阶段特异低丰度表达,但是根据4个发育阶段杂交数据的趋势线,这些基因在子孢子和裂殖子阶段应高丰度表达.本研究为研制新的抗球虫药物提供了实验依据.
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鸡柔嫩艾美耳球虫江苏分离株5401基因的克隆、序列分析及原核表达
分别以孢子化卵囊及第2代裂殖子为材料,应用RT_PCR技术克隆了柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)江苏分离株5401基因.测序结果表明该序列全长为864 bp,序列本身是一个开放阅读框,将克隆得到的基因与国外报道的5401基因比较,第174位和第287位发生突变,碱基分别由T突变为C,由C突变为T.第1个为无义突变,第2个突变引起第96位氨基酸由A变为V.其核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%.将所获5401基因克隆到pGEX-4T-2获得重组质粒pGEX-4T-2-5401,转入宿主菌BL21中,用IPTG进行诱导表达.用大鼠抗柔嫩艾美耳球虫子孢子高免血清对原核表达产物进行Western Blotting检测,结果表明有2条融合蛋白,大小分别为90 kDa和80 kDa左右.
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柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠中一些兼性厌氧共生菌的影响
兼性厌氧菌是鸡盲肠中共生微生物菌群的重要组成部分.本文对鸡感染柔嫩艾美耳球虫后盲肠中一些兼性厌氧微生物的变化情况进行了研究.结果表明:鸡在感染球虫后第7、10、14天时盲肠中肠杆菌的数量显著升高(P<0.05);消化链球菌的数量显著减少(P<0.05);在球虫感染后的第7天时,盲肠中链球菌数量呈显著下降(P<0.05),而在第10、14天时则无明显变化.
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鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因sag10在毕赤酵母中的表达及鉴定
sag基因家族是制备基因工程疫苗重要的候选基因.本研究通过在毕赤酵母Pichia pastoris中表达柔嫩艾美耳球虫Eimeria tenella表面抗原基因sag10,来探讨sag10表达后的生物学活性.本文首先提取柔嫩艾美耳球虫北京株第2代裂殖子总RNA,根据GenBank报道序列(AJ586552)设计引物,应用RT-PCR技术扩增得到鸡球虫表面抗原sag10基因.然后将sag10与真核表达载体pPIC9K连接,构建了pDQ052分泌型真核表达质粒,并转化毕赤酵母GS115,利用G418抗性筛选多拷贝重组菌株,进行优化表达.SDS-PAGE和Western blot检测表达结果,在43 kDa处有明显的免疫印迹条带,表明目的蛋白得到表达,而且能被特异性抗体所识别,说明表达的SAG10蛋白具有生物学活性.
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柔嫩艾美耳球虫卵囊cDNA文库的初建
利用Trizol一步法从柔嫩艾美耳球虫孢子化10h卵囊提取总RNA.利用poly(A)Quik mRNA Isolationkit分离纯化了mRNA.采用cDNA Synthesis Kit合成cDNA,以XR-λZAP为载体,构建了cDNA表达文库,经蓝白斑筛选,其重组率为98%,滴度为0.9×106pfu/mL,扩增后滴度为1×109pfu/mL.随机取10个克隆,提取λDNA后,经PCR鉴定,插入片段长度大于0.4Kb.该cDNA表达文库的构建为下一步功能基因的筛选等奠定了良好基础.
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5株柔嫩艾美耳球虫对4种抗球虫药的抗药性
试验选择260只19日龄雏鸡,随机分成26组,每组10只,研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)南京株、凤阳株、扬州株、宣城株和蒙城株对地克珠利(Diclazuril)、马杜霉素(Maduramicin)、氯羟吡啶(Clopidol)、氯苯胍(Robenidine)的抗药性.每株球虫均设4个感染用药组、1个感染不用药组,另外设1个不感染不用药组.以POAA、RLS、ROP、ACI作为指标,判定5株球虫对4种药物的抗药性.结果表明凤阳株、扬州株和蒙城株分别仅对马杜霉素、氯苯胍、地克珠利敏感,南京株和宣城株对该4种药物均已产生不同程度的抗药性.提示目前在凤阳、扬州和蒙城地区可分别合理地使用马杜霉素、氯苯胍和地克珠利,对其它药物须减少或暂停使用.
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柔嫩艾美耳球虫srRNA部分序列测定与分析
目的克隆柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)北京分离株srRNA片段,为我国E. tenella类群分析及分子流行病学研究提供依据. 方法用蔗糖密度梯度离心法纯化E. tenella北京分离株卵囊并孢子化,用RT-PCR扩增孢子化卵囊大小为588 bp的片段,纯化后PCR产物克隆入pMD18-T,测序.将测得的序列与国外已发表的相应序列进行了同源性比较. 结果克隆了预计大小为588 bp的E. tenella北京分离株srRNA片段,序列分析显示其与国外株E. tenella相应序列同源性高为99%. 结论成功测定了我国E. tenella 北京分离株大小588 bp的srRNA片段,其与E. tenella国外分离株相应序列高度同源.
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表面活性素抗球虫作用的研究
目的 探讨表面活性素抗鸡柔嫩艾美耳球虫的效果,并对其溶血活性进行测定.方法 选取7 d龄雏鸡150只,随机分为感染不用药组、抗球虫药(氨丙啉)饮水组、灌胃表面活性素(surfatin)组、肌肉注射表面活性素组及不感染不用药组.除不感染不用药组外各组均人工感染1×105个孢子化卵囊.于感染后第7 d收集粪便、第9 d剖杀观察各组抗球虫效果.脂肽的溶血活性利用比色法测定.结果 感染不用药组、抗球虫药饮水组、灌胃和肌肉注射表面活性素组抗柔嫩艾美耳球虫指数(ACI)分别为14.02、190.20、163.97和107.07.表面活性素溶血活性随浓度的增加而升高.结论 口服表面活性素具有中效抗柔嫩艾美耳球虫效果,并且多次口服给药效果要好于1次肌肉注射给药,但低于已知的抗球虫药氨丙啉,表面活性素具有溶血活性.
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柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1与微线蛋白-2相互作用的鉴定
目的 研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(EtAMA1)与微线蛋白-2(EtMIC2)之间的相互作用. 方法 以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增EtAMA1和EtMIC2基因,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-EtAMA1及捕获载体pGADT7-EtMIC2并转化Y2HGold酵母菌中,观察酵母在营养缺陷选择培养基上的生长情况.原核表达 GST-EtAMA1和His-EtMIC2融合蛋白,纯化后进行GST-Pulldown试验.同时构建真核表达载体pcDNA3.1-His- EtAMA1和pcDNA3.1-HA-EtMIC2并转染HEK-293T细胞,收集细胞裂解液,进行免疫共沉淀试验.在此基础上构建双分子荧光互补载体pEtAMA1-Myc-LC151和pEtMIC2-HA-KN151并转染HEK-293T细胞,激光共聚焦观察转染细胞荧光发生情况. 结果 诱饵基因和捕获基因均对酵母双杂交系统无自激活和毒性作用,pGBKT7-EtAMA1/ pGADT7-EtMIC2共转化菌能激活酵母双杂交报告系统;原核表达并纯化GST-EtAMA1和His-EtMIC2融合蛋白进行 GST-Pulldown试验,二者可在体外相互作用;EtAMA1和EtMIC2可在HEK-293T细胞中共表达,免疫共沉淀试验进一步证实二者间的相互作用;双分子荧光互补技术验证EtAMA1和EtMIC2在细胞内存在相互作用. 结论 通过酵母双杂交、GST-Pulldown、免疫共沉淀及双分子荧光互补技术验证柔嫩艾美耳球虫顶膜抗-1(EtAMA1)与微线蛋白-2(Et- MIC2)之间存在相互作用,这为揭示微线蛋白在鸡球虫入侵宿主细胞过程中的分子机制提供了理论基础.
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柔嫩艾美耳球虫ADF基因重组卡介苗的构建及其免疫保护性研究
目的 构建鸡柔嫩艾美耳球虫ADF基因重组卡介苗并研究其免疫保护性. 方法 应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫ADF基因完整开放阅读框,克隆至pMD18-T载体中；分别用限制性内切酶Pst Ⅰ/Cla Ⅰ和PvuⅡ/Cla Ⅰ进行双酶切,ADF目的基因克隆至大肠埃希菌—分枝杆菌穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中,获得霞组质粒pMV261-ADF和pMV36 1-ADF,重组质粒电穿孔转化卡介苗.将构建的重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF疫苗通过滴鼻、口服、颈部皮下注射3种途径接种雏鸡,BCG免疫组作为对照.免疫后经口接种柔嫩艾美耳球虫卵囊,通过抗球虫指数(ACI)评价重组卡介苗疫苗的保护效果. 结果 重组卡介苗pMV26 1-ADF和pMV361-ADF采用滴鼻方式免疫保护效果较好,ACI值分别为161.47和169.21. 结论 构建的重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF对柔嫩艾美耳球虫卵囊的攻击具有一定的免疫保护作用.
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柔嫩艾美耳球虫安徽肥西(AHFX)株的分离与鉴定
目的 分离并鉴定安徽肥西病鸡盲肠内的柔嫩艾美耳球虫.方法 通过雏鸡进行单卵囊接种与增殖试验,对所获卵囊用形态学方法进行初步鉴定；运用PCR方法扩增该分离株的ITS-1基因序列,并与相关序列进行比对、构建系统进化树.结果 该球虫分离株孢子化卵囊的平均大小为21.1 μm ×18.0 μm,卵形指数为1.17,潜隐期为140 h；其ITS-1基因序列与柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)GQ856310相似性达98.2％,二者的亲缘关系非常接近.结论 该球虫分离株为柔嫩艾美耳球虫(E.tenella),暂命名为柔嫩艾美耳球虫安徽肥西(AHFX)株.
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柔嫩艾美耳球虫诱导鸡巨噬细胞Toll样受体mRNA转录水平的变化
目的 探讨柔嫩艾美耳球虫(E.te ne lla)诱导鸡巨噬细胞Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)mRNA转录水平的变化.方法 用有病毒和无病毒E.tenella分别刺激鸡巨噬细胞,于刺激后0、l、2、4、6、8h收集鸡巨噬细胞,Trizol试剂提取总RNA,经qRT-PCR法检测鸡Toll样受体(chicken TLRs,ChTLRs)表达的动态变化.结果 有病毒E tenella刺激鸡巨噬细胞的ChTLR1和ChTLR21 mRNA的转录水平于刺激4h时达高,ChTLR4、ChTLR7、ChTLR15 mRNA的转录水平于刺激2h时达高,ChTLR2、ChTLR3、ChTLR5 mRNA转录水平于刺激4h后显著下调,与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).无病毒E tenella刺激鸡巨噬细胞各时间点的ChTLR1、ChTLR4、ChTLR21 mRNA的转录水平与对照组差异均无统计学意义(P＞0.05);ChTLR15 mRNA的转录水平于刺激2h时达高,ChTLR2、ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7 mRNA转录水平于刺激4h后显著下调,与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 ChTLR7和ChTLR21可能与鸡的抗Etenella病毒的先天性免疫应答有关,为E.teneUa感染的天然免疫机制的研究及鸡E teneUa病的防控奠定了基础.
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柔嫩艾美耳球虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因核酸疫苗的免疫保护效果
目的 观察柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor,Serpin)基因核酸疫苗对E.tenella感染雏鸡的免疫保护效果.方法 取14日龄雏鸡,随机分为7组:pVAX 1-Serpin高剂量组(100 μg/只)、pVAX1-Serpin中剂量组(50 μg/只)、pVAX1-Serpin低剂量组(25μg/只)、pVAX1组(50μg/只)、E.tenella卵囊组(15日龄时,口服5 000个卵囊/只,不加强免疫)、未免疫攻虫对照组(0.1 ml PBS)和未免疫未攻虫对照组(0.1 ml PBS),除E.tenella卵囊组外,均经胸肌注射免疫,21日龄时加强免疫1次,28日龄时,除未免疫未攻虫对照组外,均经口感染1×104个E.tenella孢子化卵囊.攻虫后第8天剖杀,计算各组的存活率、平均增重、相对增重率、盲肠病变减少率、卵囊减少率及抗球虫指数(Anticoccidial index,ACI).结果 未免疫攻虫对照组和pVAX1组的存活率分别为75％和70％,其余各组的存活率均为100％.pVAX1-Serpin高、中剂量组、E.tenella卵囊组和未免疫未攻虫对照组的平均增重2均较未免疫攻虫对照组显著增加(P＜0.05),其中pVAX1-Serpin高剂量组相对增重率2达95.26％;E.tenella卵囊组、pVAX1-Serpin高、中剂量组的盲肠病变记分明显低于pVAX1组和未免疫攻虫对照组(P＜0.05),前两组病变减少率较高；各免疫组卵囊产量均较未免疫攻虫对照组显著下降(P＜0.05),pVAX1-Serpin高剂量组卵囊减少率达67.04％;各免疫攻虫组ACI值均高于未免疫攻虫对照组,其中E.tenella卵囊组高(181.23),pVAX1-Serpin高剂量组次之(166.26),而pVAX1-Serpin中、低剂量组和pVAX1组均小于160.结论 高剂量pVAX1-Serpin对鸡E.tenella感染具有一定的免疫保护作用.
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柔嫩艾美耳球虫GZ株λMzp5-7重组抗原的免疫保护性实验
目的用柔嫩艾美耳球虫 (Eimeria tenella)孢子表面蛋白基因在大肠杆菌中的表达产物免疫雏鸡,观察其诱导产生的免疫应答反应和对球虫攻击的保护性作用.方法重组抗原经肌肉注射菌体蛋白和口服工程活菌分别于 7、 14、 28日龄 3次免疫海兰小公雏,同时设菌体蛋白+小剂量活卵囊组、未免疫攻毒组、未免疫未攻毒组作对照,采用间接 ELISA法、流式细胞仪技术检测鸡体产生的免疫应答反应.于末次免疫后 2w(42日龄)用 5× 104个 E.tenella卵囊进行攻毒,观察其诱导产生的保护力.结果口服工程活菌组无论从卵囊记数、盲肠病变记分、相对增重、抗体产生水平以及细胞免疫水平上均优于其它免疫组.结论λ Mzp5- 7基因在大肠杆菌中的表达产物对鸡柔嫩艾美耳球虫的攻击有一定的免疫保护作用.
关键词： 柔嫩艾美耳球虫 λ Mzp5- 7重组蛋白 免疫保护性 -
鸡柔嫩艾美耳球虫cDNA文库构建与表达序列标签分析
为系统分析鸡球虫敏感虫株和抗药虫株不同发育阶段的基因表达情况,利用柔嫩艾美耳球虫敏感株和抗马杜霉素株(由敏感株诱导)的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子为材料构建了一个混合cDNA文库,并用该文库获得了2 806条3'端高质量的表达序列标签(ESTs).通过生物信息学分析:EST序列拼接出1 424个假定独立转录本(TUTs),冗余度为49.3%.从cDNA文库中筛选出大量的低丰度表达基因,约占TUT总数的91.5%,且功能未知基因约占TUT总数的83.6%.在功能注释基因中,编码MIC2蛋白、BT1家族蛋白和核糖体蛋白等入侵和发育相关的基因高丰度表达.
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抗原虫药物种类及其临床应用研究
抗原虫药主要包括抗球虫药、抗锥虫药、抗梨形虫药、抗滴虫药四大类.其中球虫主要寄生于肠道,其中柔嫩艾美耳球虫主要寄生于盲肠,常见且致病力强;毒害艾美耳球虫寄生于鸡小肠中段;堆型艾美耳球虫寄生于鸡小肠前段;巨型艾美耳球虫寄生于鸡小肠中段;另外其他种属动物都可感染球虫病,该病对养鸡和养兔专业户造成经济损失尤其较大.
