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中华按蚊前酚氧化酶基因部分序列的基因结构和功能预测
前酚氧化酶是一种黑色素合成酶,是节肢动物体内的一种重要免疫蛋白.为了克隆中华按蚊Anopheles sinensis前酚氧化酶(Prophenoloxidase,PPO) 基因部分序列,根据已报道的多种昆虫 PPO 氨基酸的保守序列设计简并引物,以中华按蚊总 RNA 为模板进行RT-PCR 扩增,目的片段经 TA 克隆后测序.所得中华按蚊 PPO 基因(ASPPO) 部分序列长597 bp,编码 199 个氨基酸;与几种近缘蚊种的PPO基因序列同源性分别达57%~100%不等.经在线比对,该序列在基因组中分属两个外显子区域,中间含有一个内含子.推导的氨基酸序列含有两个铜离子结合位点,与目标序列相符,表明成功克隆出ASPPO部分序列.所得序列登录GenBank,登录号:JX295575,JX295576.推导的氨基酸序列提交瑞士蛋白质空间构象模拟平台Swiss-model,以冈比亚按蚊免疫相关前酚氧化酶为模板进行空间3D构象模拟,SPDview软件分析拉氏构象图.结果显示拉氏构象得分较高而QMEAN得分较低,近似跨膜蛋白值,提示该该蛋白是否为中华按蚊中肠和血淋巴疟原虫免疫蛋白尚不确定,需进一步研究.
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按蚊中肠前酚氧化酶原与约氏疟原虫卵囊黑化的关系
目的分析约氏疟原虫卵囊黑化期间按蚊中肠内前酚氧化酶原(Prophenoloxidase,PPO)的变化,探讨中肠PPO与疟原虫卵囊黑化的关系. 方法解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后3、5、7、11和15 d斯氏与大劣按蚊中肠,匀浆后经SDS-PAGE和转膜,以抗烟草天蛾PPO的抗体进行免疫印迹分析,并于感染后第5 d开始在镜下观察约氏疟原虫卵囊黑化情况,直至第15 d止. 结果斯氏与大劣按蚊中肠在约氏疟原虫感染前和感染后的不同时期经免疫印迹均可检测到1条分子质量约为67 ku的PPO阳性蛋白带,但感染后的PPO蛋白带比感染前明显增强,而且同时间点大劣按蚊中肠PPO蛋白带比斯氏按蚊明显,尤其在感染的后期大劣按蚊中肠PPO蛋白带明显比斯氏按蚊增强;在感染后7 d可见大劣按蚊中肠内发育的约氏疟原虫卵囊部分黑化,在15 d时可见疟原虫卵囊完全黑化. 结论按蚊中肠PPO含量增加,尤其是长时间内维持在较高水平与约氏疟原虫卵囊黑化密切相关.
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约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶的变化
目的比较分析约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)的分布及其变化,探讨中肠PPO与按蚊抗疟原虫感染免疫防御反应的关系.方法解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后3、5、7、11和15 d斯氏按蚊与大劣按蚊的中肠.利用烟草天蛾PPO抗体分别进行免疫组化染色和免疫印迹分析.结果斯氏按蚊与大劣按蚊在未感染约氏疟原虫前的中肠循环管道内均已存在PPO,而感染后循环管道内的PPO扩散到中肠组织间隙并聚集成片状、块状或条索状,大劣按蚊中肠PPO的聚集程度大于斯氏按蚊;在感染前和感染后不同时期免疫印迹均可检测到斯氏按蚊与大劣按蚊中肠PPO蛋白带,分子量约为67×103,感染后的PPO蛋白带型比感染前明显增强,而且大劣按蚊中肠PPO蛋白带型比斯氏按蚊尤为明显.结论约氏疟原虫感染前按蚊中肠循环管道内存在的PPO可能是经与血淋巴相通的循环管道扩散而来,感染后导致的中肠内PPO不同分布及其变化可能与疟原虫感染按蚊密切相关,并可能具有重要的生理学意义以及与激活按蚊抗疟原虫感染的免疫防御反应相关.
