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RNAi的作用机制与抗病毒效应的研究进展
RNAi广泛存在于各种生物体,是参与细胞防御与分化调控的机制之一.RNAi的作用由dsRNA启动,通过在转录水平、转录后水平、翻译水平等多个水平上,对同源基因表达的特异阻断和抑制来实现的.RNAi技术具有高效、特异、易构等特点,为病毒感染性疾病的预防和治疗开辟了一条崭新的途经.本文就RNAi的作用机制及其抗病毒效应作一综述.
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HIV-1 LTR区转录功能研究进展
作为获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的病原体,HIV-1基因组结构复杂,编码大量调节蛋白与辅助蛋白.转录水平调节主要依赖细胞内前病毒长末端重复序列(1ong terminalrepeats,LTR)和病毒因子及大量细胞转录因子的相互作用实现.本文就HIV-1 LTR区的转录调节功能的研究进展作一综述.
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Cr(Ⅵ)干涉VDAC1 mRNA表达与细胞内ATP水平的联系
目的 探讨Cr(Ⅵ)对细胞内电压依赖性离子通道(VDAC1) mRNA表达和三磷酸腺苷(ATP)水平的干涉效应及其之间的联系.方法 实验共分成6个处理组,分别用O、2、4、8、16和32μmol/L Cr(Ⅵ)染毒处理12、24和36 h,然后用逆转录荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和荧光素生物发光法分别检测细胞内VDAC1mRNA和能量ATP水平.结果 (1)细胞内VDACl mRNA表达在12h明显低于对照组水平,在24h表达水平有所增加,染毒36h后,各剂量组均明显增加,平均增加至对照组的2.65倍;(2)细胞内ATP含量在12h增高,高剂量组(2μmol/L)尤为明显,在24h后细胞内ATP水平明显下降,染毒36h后,低剂量(2μmol/L和4μmol/L)组ATP含量又回升至对照水平,在高浓度(8、16和32μ mol/L)组,ATP仍处较低水平;(3)相关分析显示,细胞内VDAC1 mRNA表达与ATP水平之间呈中度负相关(r=0.604,P<0.05).结论 Cr(Ⅵ)对细胞内ATP水平的干涉效应与VDAC1 mRNA表达异常有关,VDAC1 mRNA表达增加是Cr(Ⅵ)诱导细胞内能量ATP水平降低的分子机制之一.
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白细胞介素8基因多态性与河南省汉族人群胃癌关系的研究
全球约25%的癌症与慢性感染或炎症有关[1],后者也是导致胃癌发生的重要因素之一[2].在慢性炎症发展为胃癌的病变过程中,炎症细胞因子起到了很重要的作用[3].白细胞介素8(IL-8)主要由中性粒细胞产生,属于趋化因子超家族,是一种中性粒细胞趋化因子和活化因子[4],并具有促进有丝分裂、诱导新生血管形成以及促进细胞运动等重要生物活性,与肿瘤的发生、生长和肿瘤浸润及转移密切相关[5].编码IL-8的基因位于染色体4q13-q21,含有4个外显子、3个内含子和1个近侧启动区[6],其编码序列上存在单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,其中- 251 A/T( rs4073)位点和781C/T( rs2227306)位点与IL-8的转录水平有关[7-8].笔者采用1∶1配对病例-对照研究,探讨IL-8 -251A/T、781C/T位点多态性在河南省汉族人群胃癌发病中的作用,现将结果报道如下.
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安体优调节BCAP37细胞TIMP2表达的体外实验研究
吴良村从事肿瘤防治工作40余载,精心研制了安体优(黄芩、天冬等),用于防治肿瘤患者术后的转移和复发,取得了一定的疗效.为探讨安体优防治肿瘤转移和复发的机理,进一步推广其在肿瘤临床中的使用,我们提取了安体优的主要成分黄芩甙,结合细胞培养、MTT和RT-PCR等技术,发现黄芩甙在转录水平对tissue inhibitor metalloproteinase 2 (TIMP2)有一定的调节作用.
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约氏疟原虫感染大鼠肝脏、腹腔巨噬细胞B7.1、B7.2、TGF-β、IFN-γ基因表达研究
建立约氏疟原虫--斯氏按蚊--哺乳动物模型,在感染约氏疟原虫后2 h、12 h、24 h、48 h、72 h分别提取大鼠肝脏和腹腔巨噬细胞总RNA,通过RT-PCR定量分析发现在宿主体感染约氏疟原虫后2~72 h时间段内,B7.1表达水平没有变化,而B7.2、TGF-β、IFN-γ转录水平显著上调.该现象提示疟原虫子孢子入侵引起宿主体内免疫相关基因B7.1、B7.2、TGF-β、IFN-γ mRNA转录水平发生改变,可能与哺乳动物机体针对疟原虫感染产生的免疫防御、免疫调控密切相关.
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EBER-1与LCA双标记技术
原位杂交技术和免疫组化技术都可在组织细胞原位检测核酸分子或蛋白质分子.免疫组化是一种抗原抗体反应,检测的是蛋白质水平的表达;而原位杂交则是碱基配对,是基因或转录水平的检测.将这两种方法联合应用,可在同一细胞中显示某种mRNA或相应的蛋白质、多肽及其它抗原.我们用EBER-1和LCA在同一切片上进行双标记,获得了满意的结果.
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人载脂蛋白A-I表达上调剂的发现与活性研究
目的筛选上调人载脂蛋白 A-I(ApoA-I)基因表达的新型活性化合物,并在表达和功能水平对其作用进行研究。
方法利用人 ApoA-I 基因表达上调剂筛选模型对化合物库进行筛选;对发现的活性化合物在 ApoA-I 启动子水平进行量效关系研究;利用实时荧光定量 RT-PCR 检测ApoA-I mRNA 的表达水平;利用 Western blot、ELISA 和流式细胞技术检测 ApoA-I 的蛋白表达;利用胆固醇流出试验检测 ApoA-I 介导的巨噬细胞胆固醇外流的情况。结果从20000样次化合物筛选中得到活性化合物5238B-69,在一定浓度范围内存在转录调控活性的量-效关系,当化合物浓度为0.30μg/ml 时,上调 ApoA-I 表达活性达到高值(408%),EC50为0.01μg/ml。5238B-69能显著上调 HepG2细胞中 ApoA-I mRNA 的水平;同时, Western blot 结果显示5238B-69能增加 HepG2细胞ApoA-I 蛋白的表达。ELISA 结果显示,与对照相比,5238B-69作用48 h 时,胞外 ApoA-I 水平增加了48%,流式细胞检测表明,5238B-69作用24 h 后,胞内 ApoA-I蛋白水平增加了21.4%。功能分析试验显示,5238B-69作用 HepG2细胞上调生成的 ApoA-I,能促进巨噬细胞RAW 264.7内[3H]标记的胆固醇的流出。
结论得到一个具有上调 ApoA-I 表达的活性化合物,在提高 ApoA-I 表达水平和生物学功能方面均有明显的效果。 -
基于生物学信息分析及推测PCGEM1在前列腺癌中的表达分子调控网络
非编码 RNA,包括以 miRNA、siRNA 和 piRNA 等为代表的短小 RNA 和长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。长链非编码 RNA,有别于其他小分子非编码 RNA,是目前非编码 RNA 研究的热点。随着研究的不断推进,人们发现 lncRNA 与物种进化、胚胎发育、物质代谢以及肿瘤发生等都有着密切的联系[1]。miRNA 是一类长度为21~25个核苷酸(nt)的单链 RNA,属于非编码蛋白 RNA,广泛存在于生物界,miRNA 调节人类1/3基因的表达,miRNA 是一类新发现的基因调节剂,可以在转录水平或转录后水平调节基因的表达,在肿瘤的发生与发展中扮演着“癌基因”与“抑癌基因”的角色[2]。前列腺癌基因表达标记1(prostate cancer gene expression marker 1, PCGEM1)全长1643 nt,在前列腺组织及前列腺癌组织中呈特异表达的长链非编码 RNA,但其表达调控网络目前未知[3],本文旨在运用生物学软件对其进行生物学信息分析,为下一步实验验证其表达分子调控网络机制提供线索。
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RNA介导的转录水平调控研究进展
生命的基本过程是从DNA转录成mRNA,再翻译成蛋白质发挥功能,由于蛋白质是由mRNA所编码的,因此称这些mRNA为编码RNA;相反,那些不编码蛋白质的RNA被称为非编码RNA( non-coding RNA)。长期以来,这些非编码RNA以及它们所对应的DNA被认为是垃圾或暗物质,然而研究发现,非编码RNA的比例随着生物物种进化水平的升高而升高。随着2001年人类基因组测序的完成,发现在组成人类基因组的30亿个碱基对中,仅有1.5%的核酸序列用于蛋白质编码,其余98.5%的基因组为非蛋白质编码序列,随后启动的ENCODE研究计划中发现,75%的基因组序列能够被转录成RNA,其中74%的转录产物为非编码RNA[1]。
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IL-5反义寡核苷酸对哮喘大鼠CD4+ T淋巴细胞IL-5 mRNA和蛋白质表达的影响
IL-5是哮喘中的重要调节因子.因此,阻断IL-5的合成对治疗哮喘有着积极的作用.国外研究表明[1],反义寡核苷酸技术可以较好地在转录水平阻断IL-5的表达.而且,大部分IL-5 mRNA及IL-5由CD4+ T淋巴细胞表达.由于反义寡核苷酸作用mRNA不同部位,其阻断效果可能不同.因此,我们设计了IL-5 mRNA上起始密码处、外显子-2和终止密码处的反义寡核苷酸,利用脂质体导入哮喘大鼠CD4+ T淋巴细胞,观察比较反义寡核苷酸组与空白对照组、反义寡核苷酸各组间对IL-5 mRNA及蛋白质的抑制效率.
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问号钩端螺旋体鞘磷脂酶类溶血素基因功能分析及其感染细胞后转录水平变化
目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)鞘磷脂酶类溶血素基因sph1~sph4产物溶血活性及其感染细胞后转录水平的变化.方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株、波摩那群波摩那型罗株和非致病性双曲钩体三宝垄群Patoc型Patoc Ⅰ株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长sph1~spl4基因片段,扩增产物T-A克隆后测序.构建sph1~sph4基因原核表达系统,采用SDS-PAGE检测目的 重组蛋白rSph1~rSph4的表达情况,Ni-NTA亲和层析柱提纯rSph1~rSpM.采用绵羊血平板对rSph1~rSph4溶血活性进行鉴定,实时荧光定量RT-PCR检测问号钩体赖株感染J774A.1细胞前后sph1~sph4基因转录水平的变化.结果 问号钩体赖株和罗株基因组DNA中均能扩增sph1~sph4基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.与报道的相应基因序列比较,所克隆的sph1~sph4基因核苷酸序列相似性均为100%.所构建的原核表达系统能分别表达目的蕈组蛋白rSph1~rSph4.rSph1~rSph4均有溶血活性,其中以rSph2溶血活性强.问号钩体赖株感染J774A.1细胞后,sph1~sph4基因转录水平均上调,其中sph2和sph4基因mRNA水平上调更为明显.结论 sph1~sph4基因仅存在于致病性问号钩体中,其表达产物有溶血活性.问号钩体赖株感染细胞后sph1~sph4基因转录水平的上调,提示此类鞘磷脂酶类溶血素可能在问号钩体感染宿主过程中有重要作用.
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幽门螺杆菌对AGS细胞p53、p21WAF1/CIP1和p27KIP1基因转录的影响
细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物(Cyclin-dependent kinase inhibitors,CDKIs)负调控CDKs活性,主要有p16INK4a和p15INK4b及p21WAF1/CIP1和p27KIP1等两类.p53基因亦可调控细胞周期及凋亡,异常的细胞凋亡与消化道等肿瘤密切相关.本文采用MP-RT-PCR检测了cagA+/CagA+和cagA-/CagA- Hp菌株感染前后AGS细胞p53、p21WAF1/CIP1和p27KIP1转录水平的改变,以期了解Hp诱导细胞癌变和细胞周期阻滞的关系及可能的机制.
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人早孕蜕膜组织及蜕膜基质细胞趋化因子受体及配体的转录特征
妊娠后,蜕膜化的子宫内膜(蜕膜,decidua)和发育的滋养细胞共同构成了母-胎界面.同种异体移植物的胎儿,能够在母体内存活直至足月分娩,这其中涉及母-胎界面极为复杂的免疫调节机制.蜕膜主要由蜕膜基质细胞(decidual stromal cell,DSC)(75%)和淋巴细胞构成,能分泌多种细胞因子,具有广泛的生物学功能,是母-胎界面来自母体的重要成分[1].趋化因子是一组由70~90个氨基酸组成的小分子蛋白质,在免疫调节、器官发生和炎症反应等机体生理、病理活动中发挥重要的作用.本研究以趋化因子受体及其配体为切入点,分析了早孕期蜕膜组织及原代培养的DSC 18种趋化因子受体及相应配体mRNA转录水平,以揭示蜕膜在母-胎免疫调节机制中的作用,同时也为进一步揭示母-胎免疫调节的实质提供新思路.
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慢性囊型包虫病患者外周血单个核细胞中TLR2、4、7mRNA表达水平的研究
目的 探讨慢性囊型包虫病(CE)患者外周血单个核细胞(PBMC)Toll样受体(TLRs)2、4、7基因表达变化及血清IL-10的表达情况.方法 采用实时荧光定量PCR(FQ-RT-PCR)法检测42例慢性CE患者与28例健康对照组(NC)外周血中TLR2、4、7 mRNA的表达,GAPDH作为内参基因;应用ELISA方法检测两组血清中IL-10的浓度.t检验比较两组间TLR2、4、7及IL-10的表达差异;TLR2、4、7的表达水平间及它们与血清IL-10水平间的相关性分析采用线性相关分析.结果 慢性CE组的TLR2、TLR4、TLR7的mRNA相对表达量均比NC组的表达增高,其中CE组的TLR2是NC组的7.3倍,TLR4是NC组的3.6倍,TLR7是NC组的3.6倍.CE组的TLR2、TLR4、TLR7 mRNA相对表达量分别是1.0729±0.4006、5.0976±1.6682、0.6481±0.2574;NC组的TLR2、TLR4、TLR7 mRNA的相对表达量分别是0.1468±0.0435、1.4067 ±0.3279、0.1804±0.0568.与NC组相比,CE组的TLR2、TLR4的差异均具有统计学意义(P值分别为0.0287、0.033),而TLR7则无统计学意义(P=0.0862).慢性CE组、NC组外周血清IL-10分别为(17.6770±1.6298)pg/ml、(9.4898±0.7049)pg/ml,且慢性CE组与NC组的IL-10比较,差异具有统计学意义(P=0.0002);在慢性CE组中,外周血PBMC的TLR2与TLR4在mRNA相对表达水平上呈正相关(r=0.1135,P=0.036),其他均无相关.结论 TLR2、TLR4参与了慢性囊型包虫病的发生发展过程,TLR2、TLR4可作为囊型包虫抗原的受体,与不同抗原成分相互作用,调节宿主的免疫应答,同时在血清IL-10分泌增高的作用下共同促使机体向Th2型免疫应答方向发展,从而对囊型包虫感染所产生的免疫逃避发挥着重要作用.
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急性乙型肝炎病毒感染的免疫应答
乙型肝炎病毒( hepatitis B virus,HBV)感染机体后主要有两种结局:急性自限性和慢性持续性。机体能否清除病毒,取决于感染者的年龄和免疫状态。免疫功能健全的成年人感染后大多呈现为自限性。儿童、免疫力缺陷的成年人或者母婴传播多表现为持续性感染。机体产生有效的免疫应答是清除HBV的关键因素,并且与肝脏的炎症和疾病的进展有关[1]。目前人们对HBV感染的发病机制和免疫应答还不完全清楚。本文就急性HBV感染过程中机体的免疫应答的相关进展以及争议作一综述。
一、固有免疫应答
固有免疫是抵抗微生物感染的第一道防线,但固有免疫在控制HBV感染中的作用却一直存在争议。长期以来部分学者认为HBV不被固有免疫识别,是一种潜伏病毒(stealth virus)[2]。急性黑猩猩感染模型显示, HBV感染早期,肝内与固有免疫相关的各种基因的转录水平没有明显变化,也就是不介导产生固有免疫应答[3]。近土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus ,WHV)模型也显示,WHV感染土拨鼠后肝组织内没有检测到固有免疫相关的基因表达上调[4]。与人免疫缺陷病毒( human im-munodeficiency virus,HIV)和丙型肝炎病毒(hepati-tis C virus,HCV)相比,HBV感染患者外周血内产生抗病毒相关细胞因子和趋化因子的水平明显较低,反应时间也明显延迟[5]。另外,急性HBV 感染早期,患者外周血内能检测到高水平的IL-10,从而抑制NK细胞分泌IFN-γ的能力[6]。这些结论均提示HBV感染不诱导机体产生固有免疫应答。 -
HLA-G 与慢性炎症性疾病的研究进展
非经典人类白细胞抗原G( human leukocyte an-tigen-G, HLA-G)是机体内重要的免疫耐受分子,经选择性剪切可产生4种膜结合型 HLA-G 蛋白( mHLA-G,HLA-G1~G4)和3种可溶型HLA-G蛋白( sHLA-G, HLA-G5~G7)。相对于 HLAⅠ类分子,HLA-G具有有限的基因多态性,且存在多个位点和sHLA-G表达水平显著相关,其中研究多的是14 bp插入/缺失等位基因多态性(14 bp+/-多态性)。当HLA-G基因为14 bp插入纯合子时,外显子8起始区的一个92 bp片段将被剪切,从而有助于HLA-G mRNA转录水平更稳定。但HLA-G转录水平与蛋白表达存在不均一性,中国汉族人种基因型为14 bp+/+人群外周血 sHLA-G 较14 bp+/-、14 bp-/-人群外周血sHLA-G分泌水平显著降低,进一步提示HLA-G 14 bp+/-多态性在sHLA-G分泌过程中发挥了至关重要的作用[1]。
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天疱疮患者外周血单个核细胞瘦素受体mRNA的表达研究
瘦素受体主要分为长型瘦素受体(OB-Rb)和短型瘦素受体(OB-Ra).我们曾发现天疱疮患者血清瘦素水平增高及可溶性瘦素受体水平下降.为进一步探讨瘦素受体在转录水平上是否存在异常,采用RT-PCR方法对天疱疮患者外周血单个核细胞(PBMC)OB-Ra和OB-RbmRNA表达进行了检测,现将结果报告如下.
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mTOR通路通过 CD44促进神经元再生机制的研究
目的::神经损伤类疾病的治疗一直是困扰医学界的难题,主要由于神经元损伤后难以再生,因此,阐明神经元内再生的机制是治疗神经损伤类疾病的关键。研究表明mTOR信号通路是提高神经元内在再生能力的重要因素,激活mTOR可有效促进神经纤维的再生,但其作用机制尚不清楚,我们利用生物信息技术检索到mTOR通路与神经再生相关的蛋白质阵列,发现细胞粘附分子CD44与轴突再生密切相关。本研究观察mTOR通路激活后,相关CD44分子表达是否上调及其与神经元突起生长的内部联系,探讨mTOR通路是否通过CD44分子促进神经元突起生长,进而提高神经元的再生能力。方法:(1)体外培养SH-SY5Y细胞,10μMol/L全反式维甲酸诱导SH-SY5 Y细胞分化,使其具有成熟神经元的特征。(2) RNAi技术对诱导分化的SH-SY5 Y细胞PTEN基因干扰。结果:24 h后RT-PCR结果显示PTEN基因的转录水平与对照组相比明显下调。36 h后Western blot结果显示干扰组细胞的mTOR与Ps6 K蛋白的表达水平与阴性对照组和空白对照组相比明显上调,说明PTEN 抑制激活了mTOR通路。干扰PTEN基因24h之后,RT-PCR结果发现实验组CD44转录水平上调,与阴性对照组和单纯诱导组相比差异显著。(3) image proplus 6.0分别对各实验组细胞进行轴突长度测量,并将各组数据分别进行统计学分析结果表明PTEN干扰组细胞的突起长度明显长于单纯诱导组和阴性对照组。 PTEN RNAi与CD44 RNAi共同干扰后,PTEN单纯干扰组细胞轴突长度明显长于共同干扰组和单纯诱导组细胞的轴突长度,差异显著。结论:mTOR通路激活后通过CD44分子表达上调促进神经细胞轴突生长。
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FGF23-Klotho及下游信号通路在继发性甲状旁腺功能亢进发病中的作用
继发性甲状旁腺功能亢进(secondary hyperparathyroidism,SHPT)是慢性肾衰竭(chronic rehal failure,CRF)患者的常见并发症.随着肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)的下降,SHPT的发生率逐渐升高.在GFR为60~90m1/min/1.73m2的慢性肾脏病患者中,SHPT发生率为17%,当GFR降至20ml/min/1.73m2以下时,SHPT发生率增加至85%[1],其特征是甲状旁腺增生及甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)过度合成和分泌.PTH水平过高可导致骨过度重吸收,使钙磷代谢进一步紊乱,导致血管钙化、心血管疾病等严重并发症[2].SHPT的发生与多种因素有关,高血磷、低血钙、活性维生素D缺乏、肠道钙吸收不良、甲状旁腺维生素D受体(VDR)和钙敏感受体(calcium sensing receptor,CaSR)表达下调、PTH转录水平改变等均可引起SHPT的发生.近年来,国内外学者将目光聚焦于研究成纤维细胞生长因子-23 (fibroblast growth factor,FGF-23)-Klotho及其下游信号转导通路在SHPT发病机制中的作用.