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病毒核酸定量测定方法及其存在的问题
随着科学技术的不断进步,人们不但能够对病毒核酸进行定性检测,如今发展到还能够定量检测病毒核酸分子.有关定量测定病毒核酸的方法已有学者作过总结和介绍[1],但病毒核酸定量测定过程中存在的问题,却很少有人总结报道.本文根据作者在实际工作中发现的问题和参考国外有关文献,着重在这方面进行总结.但为了更好的说明这个问题,首先对定量测定病毒核酸的方法作一简要介绍.
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EBER-1与LCA双标记技术
原位杂交技术和免疫组化技术都可在组织细胞原位检测核酸分子或蛋白质分子.免疫组化是一种抗原抗体反应,检测的是蛋白质水平的表达;而原位杂交则是碱基配对,是基因或转录水平的检测.将这两种方法联合应用,可在同一细胞中显示某种mRNA或相应的蛋白质、多肽及其它抗原.我们用EBER-1和LCA在同一切片上进行双标记,获得了满意的结果.
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琼脂糖凝胶中DNA检测方法的研究进展
作为研究生命遗传物质载体——核酸的工具,琼脂糖凝胶电泳已成为高效分离和分析核酸分子的必备手段,而在电泳后对DNA的检测是关键环节,因为它直接关系到实验结果显现与否.目前,常用的琼脂糖凝胶上DNA检测方法有荧光染色法、染料染色法、金属离子染色法、负染法等.近几十年来,许多研究者对染色方法进行了改进,使灵敏度和线性动态范围都有较大程度提高.本文主要对琼脂糖凝胶电泳后的DNA检测技术方面的研究历程进行总结,并展望其未来的发展方向.
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Aptamer核酸药物的研究进展
Aptamer指的是能结合蛋白或其他小分子物质的单链或双链寡核苷酸[1].体外筛选技术的发展和PCR技术的应用,使得Aptamer的研究近年来有了长足的进步,筛选到了一大批能与各种蛋白或小分子特异紧密结合的核酸分子(Aptamer).这些Aptamer包含了RNA、双链DNA、单链DNA等多种形式的寡核苷酸,其配体的性质各异.体外筛选Aptamer不仅增强了人们对核酸-蛋白相互作用的认识,也为寻找新药提供了一条途径.Aptamer核酸药物的研究近年来也取得了一些可喜成果.我们拟就该方面的进展及相关问题作一综述.
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聚合酶链反应临床应用的优越性和局限性
聚合酶链反应(PCR)技术自1983年问世以来,因其对基因或特定核酸序列在短时间内具有极大的扩增效率,已广泛应用于感染性疾病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、法医学、动植物和考古等诊断和研究领域,并在某些方面呈现出几乎难以替代的优势.PCR用于疾病的临床诊断后,使人们对蛋白分子表型的认识,进一步深入到了遗传物质--核酸分子的探索,也使临床检验诊断学科中的临床分子诊断技术得到了飞速发展.像任何自然界的事物一样,PCR虽然有其无可比拟的优点,但也有其一定的局限性.如果在临床实际应用中,不遵循客观规则,也很容易产生非PCR技术问题所致的错误检验结果.
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分子灯塔技术及其在基因检测研究中的应用
分子灯塔(Molecular beacons)是近年兴起的利用核酸杂交技术对核酸分子进行检测的新技术,由纽约市公共健康研究协会的Tyagi等[1]于1996年首先建立。因其在与核酸分子互补结合之后荧光素便能开始发光,故称为“分子灯塔”。它的建立为研究核酸分子的组成、含量及对PCR过程中进行实时监测提供了快速、特异、方便的新方法,在基因检测领域有着广阔的应用前景。现试就其构成、原理、热力学特性、优缺点及在基因检测中的应用作一简要综述。 一、分子灯塔的构成、原理及热力学特性 分子灯塔是具有“发夹”样结构的单链寡核苷酸探针,一般为含20~30个核苷酸的2部分组成:环状部分及茎部。环状部分为单链核酸,与目标链形成特异的互补结合,茎部的2条核苷酸链互补,形成双链分子,大多含有5对碱基。茎部的末端分别与荧光素(5′端)和淬火物质(3′端)结合,淬火物质大多为4-4′二甲氮基苯偶氮苯甲酸,荧光素和淬火物质因研究目的不同可自行设计。茎部的双链互补结构使末端的荧光素和淬火物质紧靠在一起,因荧光素共振能量转移[2]作用而使荧光被吸收,这样荧光素就不能发光。当分子灯塔的环状部分与目标链特异性结合时,所形成的杂交分子比茎部双链结构更稳定,它的刚性使茎部双链分子分离,也就使荧光素和淬火物质相分离,通过自发构型重组作用,在室温下就可使荧光素发光得以恢复,通过荧光仪或合适配置的显微镜可观察到。在分子灯塔与目标链结合的过程中,因环境温度的不同,存在着3种不同的状态:在低温时与目标链结合,即为结合态,当温度升高至42℃时,分子灯塔与目标链的复合物变性,成为“发夹”样结构,导致荧光强度的下降。当温度升高至54℃时,出现茎部结构的变性,分子灯塔成为松散的随机卷曲状态,荧光强度上升。相比之下,如果分子灯塔与目标链有一个核苷酸不能互补,则解链温度要相应地下降约14℃[3]。
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miRNA-193a在肾细胞癌中的表达情况
miRNA是一类长度很短的非编码、转录后调控单链小分子的RNA,长度约22个核苷酸,它控制着真核细胞的诸多功能,影响其基因表达、细胞周期和个体发育等行为[1].这类小核酸分子可能发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用,参与了人类肿瘤的发生和发展[2].
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85例支原体肺炎核酸分子杂交检测结果报告
支原体为临床引起原发性非典型性肺炎的一种重要病原体,晚近报告颇多,并有局部流行趋势[1].本病诊断长期依赖于血清抗体滴度测定及病原体分离培养等.但因存在耗时较久,检出阳性率颇低以及灵敏性和特异性欠佳等缺点,致使不能达到临床早期诊断的目的.
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缺乏两种小核糖核酸会导致不孕
当今社会不孕症的发病率有明显上升趋势,而无法顺利排卵是导致不孕症的重要原因之一.日本的一个研究小组在动物实验中发现,如果缺乏两种特定的小核糖核酸(miRNA),会引发排卵障碍.小核糖核酸是一类不编码制造蛋白质的单链核糖核酸分子,主要参与控制基因表达,调节各种基因的功能.大阪大学微生物病研究所的研究小组在实验中发现,如果雌性实验鼠体内缺乏miR-200b和miR-429这两种小核糖核酸,就难以怀孕.这两种小核糖核酸是由脑垂体大量分泌的.
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关节软骨损伤基因治疗的研究进展
关节软骨损伤是临床上常见的问题,其自愈能力有限,传统的治疗方法难以取得满意的效果,是医学界的一大难题.近些年研究表明,基因治疗可能成为解决这一难题的有效手段.基因治疗是指将核酸分子导入细胞乃至体内,使其在体内表达,从而改变疾病进程.基因治疗的内容主要包括:目的基因和靶细胞的选择,基因导入的方法和载体的选择.本文从基因治疗的内容出发,阐述其对关节软骨损伤治疗的重要性和可行性,并提出基因治疗在关节软骨损伤中存在的问题和展望.
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妇科门诊就诊者人乳头瘤病毒感染606例分析
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是宫颈癌的主要病因,其中,不同型别的HPV的致病性存在着差异,因此HPV感染的监测是宫颈癌筛查的主要内容.为了解我院妇科门诊患者HPV感染情况,我院用核酸分子快速杂交基因分型技术进行了人乳头瘤病毒的基因检测研究,现报告如下.
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保健食品中总核酸的测定
测定核酸的化学方法都是以测定核酸中磷含量,戊糖含量或碱基含量为基础.根据所用仪器试剂的不同又可分为比色法、高效液相色谱法、薄层层析法、紫外吸收法、荧光法、离子交换色谱法等.但目前食品及保健食品中核酸的测定方法缺乏统一规定,更没有国家标准方法,因而在对食物中核酸测定和评价时造成很大的不便和困难.定糖法测定核酸含量需要分别测定RNA和DNA,再计算核酸总量,而且蛋白质,多糖类等物质对其测定有一定的影响,并且需要昂贵的试剂.以测定碱基定量的紫外吸收法虽然快速,灵敏度也较高,但此法在测定粗制品时,蛋白质、色素等其他紫外吸收杂质对结果有干扰作用,且大分子核酸在变性、降解后有增色现象,特别是对大分子核酸的测定此法精确度较差.本文选用定磷法测定保健食品中核酸的含量,由于核酸分子中含有一定比例的磷且含量比较接近和恒定,测定样品中磷的含量即可推算出核酸的总量,不再需要分别测定,并且选用钒-钼酸铵比色法代替钼蓝比色法,克服了以往钼蓝法不稳定,重现性差的缺点,此法简便易行,准确性、重现性较好,灵敏度较高,结果令人满意.现报告如下.
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抗氧化性药物的研究进展
近年来的研究表明,不少疾病的起因均与自由基有关.人体由于受到外源辐射、体内酶促或非酶促反应与一些有毒药物及毒物侵害都会产生自由基,适量的自由基可显示出独特的生理作用,而在某些病理情况下,生物体内过剩的自由基可损伤生物大分子脂肪、蛋白质、核酸分子,生成丙二醛等有害物质,影响生物膜功能或破坏蛋白质构象,引起机体损伤变性,产生生理病理变化.生物体内抗氧化作用主要是通过清除过量自由基、防止脂质过氧化引起的系列病变而完成的.因此,研制和开发高效低毒的抗氧化性药物越来越受到人们的重视.笔者综述了近些年来抗氧化性药物的研究进展.
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地高辛标记的cDNA探针检测 IL-6mRNA表达的方法
IL-6(interleukin-6)是一种由多种细胞分泌的细胞因子,在血液病及心、脑疾病时有异常表达.IL-6被认为是目前治疗各种血小板减少症的佳药物,在治疗白细胞减少症及抗白血病、抑制肿瘤转移及骨髓移植方面也有重要作用.迄今,IL-6的检测多采用以细胞培养为基础的生物学活性检测,该方法不仅难以反映IL-6基因转录水平,而且特异性和灵敏度均受到限制.本文采用随机引物法对人IL-6cDNA探针进行地高辛标记,核酸分子原位杂交技术,建立了在转录水平上直观检测IL-6mRNA表达的实验技术,为研究IL-6的基因表达与调控奠定了基础.
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核酸分子生物学技术在隐孢子虫研究中的应用
核酸分子技术是建立在任何一种生物均具有独特的核苷酸系列的基础上对核酸分子进行研究的方法,随着现代分子生物学技术的迅速发展,对某一生物(包括寄生虫)的核酸有了深入的研究,并已经用于寄生虫的研究[1],所涉及的研究方法有分子杂交技术、DNA探针〔2〕、PCR(多聚酶链反应)〔3〕、随机扩增多态性DNA分析(RAPD)〔4〕和核酸序列分析〔5〕等。人体隐孢子虫病ryptosporidiosis)1976年在美国首次报道,国内于1987年由韩范在南京第一次报道〔6〕,以后在世界各地包括中国各地陆续有隐孢子虫病病例报道,甚至在特定人群中有暴发流行〔7,8〕。在隐孢子虫研究中核酸分子技术上主要应用于样本中隐孢子虫卵囊检测、隐孢子虫病的诊断、流行病学调查及虫种鉴定和虫株分型。核酸技术用于隐孢子虫病诊断,可以用于鉴别隐孢子虫的近源种或不同株型,在流行病学调查中确定传播途径或考核治疗效果。目前这些方法大多处于研究阶段,在临床或大面积应用时还受到一定限制。
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基因决定你的乳房
所谓基因,就是DNA分子上具有遗传效应的特定片段,它藏有遗传信息,向细胞发出各种"指令",指挥生物按一定方式发育、繁殖、衰老,直至死亡.基因可分两大类,一类叫结构基因,它是表达生物特性的;另一类叫控制基因,它是控制基因的基因.例如,植物开什么颜色、什么样子的花,是由结构基因决定的,至于什么时候开花,则由控制基因决定.虽然基因有点"顽固",但它还是可以改变的,一旦生物受到环境剧烈或长期的影响,就会引起脱氧核糖核酸分子的某种变化,导致基因突变,从而使生物体发生变化.
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脱氧核糖核酸分子遗传标记技术在中药鉴定中的应用
中药传统从基原、性状、显微及理化等方面进行药材品种的鉴别.这些方法简便易行,对于植物药、矿物药和大多数以整体入药而保持其分类学性状特征的动物药的鉴定确实是行之有效的,所以一直沿用至今.然而一些局部入药的动物药材或经过多道工序炮制加工后的药材或是道地药材,有的失去其原本性状而难辨真伪,有的难以分辨品质优劣.尤其是道地药材和贵重的动物药材,如熊胆、鹿鞭、牛黄等,由于传统的鉴别方法难以很好进行鉴别,造假问题尤其严重,阻碍着中药的发展,这一矛盾亟待解决.近10年来,分子生物学技术在农业、生物工程、环境保护、畜牧水产等领域都得到了广泛的应用,为中药材鉴别提供了一个崭新的研究思路.
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肾上腺嗜铬细胞瘤C-myc mRNA及蛋白表达的临床意义
目的:探讨癌基因C-myc及其表达产物在肾上腺良性及恶性嗜铬细胞瘤发生中的作用。方法:应用核酸分子原位杂交及免疫组织化学方法检测29例良性肾上腺嗜铬细胞瘤及7例恶性肾上腺嗜铬细胞瘤中C-myc基因及其产物表达情况。结果:原位杂交结果显示:C-myc mRNA在良性肾上腺嗜铬细胞瘤中表达率为27.5%(8/29),而在恶性肾上腺嗜铬细胞瘤中为71.4(5/7)(P<0.05);免疫组化结果显示:C-myc蛋白表达率分别为31.0%(9/29)和71.4%(5/7)(P<0.05);结论:在肾上腺嗜铬细胞瘤的发生过程中,C-myc基因可能对该肿瘤的恶性变起重要作用;C-myc基因产物的检测对鉴别良、恶性肾上腺嗜铬细胞瘤有一定意义。
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边缘系统相关膜蛋白mRNA在纹状体边缘区的转录分析
纹状体边缘区(Marginal djvision,MrD)由舒斯云教授于1988年首先发现并进行了大量研究,发现该区域与学习、记忆有关,并提出其可能为边缘系统的一部分.为证实这一假设,本研究在大鼠脑组织切片中对边缘系统特定标记分子-边缘系统相关膜蛋白(Limbic system-associated mcmbrane protein.LAMP)mRNA在该区域的转录进行了测定.实验取雄性SD大鼠10只,10%水合氯醛腹腔麻醉后,剖开胸腔,切开右心房,将穿刺针通过左心室进入升主动脉,4℃生理盐水冲洗后,4%多聚甲醛灌注固定,30%蔗糖中沉底后,应用冰冻切片机-20℃下切片,厚度为30μm.采用核酸分子原位杂交技术对LAMP的mRNA转录进行测定.原位杂交所用探针由含53个碱基的寡核苷酸构成,其序列取自大鼠LAMP的cDNA第918至970个核苷酸,由中科院上海生化所DNA合成室合成,应用地高辛标记,杂交完毕后,应用NBT显色,光学显微镜下观察.
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生物芯片技术在医学检验中的应用
生物芯片技术是指通过微加工技术在固体芯片表面构建微型生物化学系统,将大量特定序列的核酸片段或蛋白质有序地固定在载体上,与标记的核酸分子或与待检的蛋白质进行反应,通过检测荧光信号的强弱而判断样品中的靶分子数量,以实现对细胞、蛋白质、核酸及其它生物组分进行快速、敏感、高效地处理.