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树突状细胞抗病毒抗肿瘤临床应用探讨
树突状细胞(DC)是功能强大的抗原呈递细胞,它具有激活初始型T细胞和诱导初级免疫应答的特殊能力.近年来有关DC体外分离、培养和纯化技术、合理选择细胞因子激活;选择病毒或肿瘤抗原导入DC诱发细胞免疫等技术均有很大进展,将为临床上抗病毒、抗肿瘤的治疗开辟新的途径.本文综述了近几年有关DC在此领域方面的研究进展.
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原发性肝癌的免疫治疗进展
原发性肝癌是严重危害人类生命和健康的重要疾病,为我国恶性肿瘤第二位死因,5年生存率不足5%[1].目前肝癌的主要治疗手段是手术、介入栓塞化疗及肝移植等,但肿瘤复发转移和晚期肝癌的治疗仍是迫切需要解决的问题.肿瘤的免疫治疗是近年来具有广阔前景的新疗法,通过增强机体免疫反应,激发肿瘤特异性免疫,打破免疫耐受,以达到延缓肿瘤进展,甚至治愈肿瘤的目的.本文对肝癌的免疫治疗现状和进展做一综述.
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肿瘤抗原的表达特性和筛选方法研究进展
恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康,其死亡率已占到各类疾病所致死亡的第二位,并且还有上升的趋势.人类对肿瘤的认识和研究经历了一个相当长的过程,但目前已广泛使用的传统治疗方法所取得的疗效仍十分有限,还不能从根本上治愈肿瘤.随着科学技术的迅速发展,从分子水平研究肿瘤发生、发展的机制以及肿瘤的早期诊治成为攻克肿瘤的一个研究热点.
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氩氦超导手术治疗系统
一、前言随着冷冻治疗技术的不断发展,越来越多的含有高新技术的冷冻治疗设备不断涌现.近年来美国Endocare公司将太空火箭制导技术应用于医学领域,成功研制了氩氦超导手术治疗系统即氩氦刀,由于它具有独特的快速冷冻和加热系统,解决了超低温对正常组织的冷冻伤害这个难题,同时可急速加热至一定的温度再进行二次快速冷冻,又可以调控肿瘤抗原,激活抗癌瘤免疫反应.这种集超低温冷冻、介入热疗和免疫治疗三种功能于一体的治疗系统,它代表国际上九十年代末超低温冷冻仪器的先进水平,也引起超低温手术和肿瘤治疗的革命.我医院近引进的该治疗系统,经过临床应用,效果显著.下面简单介绍其原理及特点.
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原发性肺癌中医证型与TNM分期及肿瘤抗原相关性研究
目的：研究原发性肺癌患者中医证型与TNM临床分期及肿瘤抗原的相关性，为中医药防治原发性肺癌提供理论支持和用药指导。方法：将388例肺癌患者按照相关证型进行数据统计，分析肺癌患者的证型分布情况及与TNM临床分期及肿瘤标志物之间的相关性。结果：①临床TNM不同分期中，肺阴虚证在第I期的发病率明显高于第IV期；脾气虚证在第IV期的发病率明显高于第I期；肺气虚证、瘀阻肺络证、肺阴虚火旺证在不同分期中的发病率均无明显差异。②CEA在肺阴虚火旺证中明显高于肺阴虚证、肺气虚证及瘀阻肺络证。NSE在肺阴虚火旺证中异常升高比例明显高于其它证型。CYFRA21-1在肺阴虚火旺证及瘀阻肺络证异常升高比例明显高于肺气虚证。结论：①肺癌患者中医证型与TNM临床分期具有一定相关性。肺阴虚证贯穿于肺癌始终，在早期阶段尤为明显；脾气虚证则多见于肺癌的晚期阶段。②肺癌患者不同中医证型与肿瘤抗原CEA、NSE、CYFRA21-1的异常升高具有一定相关性。
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调节DC抗原递呈功能--中西医结合抗肿瘤免疫治疗思路研究
细胞免疫应答是机体抗肿瘤主动免疫应答反应的主要途径.抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)尤其是分化成熟的树突状细胞(dendritic cell, DC)向T细胞(包括CD4+、CD8+细胞)有效地递呈肿瘤抗原,是机体抗肿瘤免疫应答的关键.
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肝癌患者血清和癌组织中锌指蛋白216表达增加
目的 寻找肝癌相关抗原.方法 应用SEREX技术对肝癌组织cDNA文库进行血清学筛选,获得人类锌指蛋白ZNF216.利用原核表达和亲和层析技术获得ZNF216的6*His融合蛋白,建立间接ELISA方法,检测血清中产生的ZNF216抗体水平;利用RT-PCR技术检测肝癌患者肝癌组织及癌旁组织内ZNF216 mRNA的水平.结果 肝癌患者血清中产生的抗ZNF216抗体水平高于正常个体,ZNF216 mRNA在肝癌组织内的表达明显高于癌旁组织.结论 ZNF216在肝癌病人血清及癌组织内的过表达可能参与肝癌的发生,但还需要进一步研究证明.
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胰岛内分泌细胞及其肿瘤某些抗原表达的定位研究
目的对正常胰岛及胰岛细胞瘤的某些抗原进行检测,并对其临床病理意义进行探讨.方法采用免疫组化方法对正常胰岛细胞及52例胰岛肿瘤的α-人绒毛膜促性腺激素(α-HCG)、孕激素受体(PR),7B2,HISL-19,抗原进行定位观察.结果发现α-HCG在正常胰岛细胞不表达,在良性胰岛细胞瘤表达为3/28(10.7%);恶性胰岛细胞瘤为14/24(58.3%).PR分别为20/28(71.4%)及7/24(29%);7B2分别为23/28(82.1%)及13/24(54.7%);HISL-19分别为23/28(82.1%)及11/24(46%).结论胰岛细胞瘤的某些抗原的表达可能对判断其良恶性有一定的参考价值.
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间皮瘤相关特异性抗体的研究进展
自1979年Singh等[1]用培养的人反应性间皮细胞悬液作免疫原制备多克隆抗间皮细胞抗体以来,陆续用人恶性间皮瘤(MM)细胞株研制了MAb45,anti-MS和ME1等抗体.另外,识别卵巢肿瘤抗原的抗体OV632和K1及抗维尔姆斯瘤抗体anfi-WF1,在MM中亦有较高的敏感性和特异性.
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嵌合抗原受体设计的NK细胞在多发性骨髓瘤中的应用研究
目的:通过建立CAR(CD138-CD28-CD3ζ)-NK细胞,探讨CAR(CD138-CD28-CD3ζ)-NK细胞对多发性骨髓瘤的抗肿瘤作用.方法:把抗CD138scFv-CD28-CD3连接到pcDNA3.1质粒,使用三质粒慢病毒包装系统转染293T细胞,收集病毒后感染NK92MI细胞系,应用嘌呤霉素筛选阳性细胞株;通过RT-PCR及West-ern blot检测CAR在NK92MI细胞系的表达,流式细胞术检测NK92MI细胞分泌细胞因子cd107a的能力.结果:经过基因工程技术,体外构建了CAR基因片段,基因测序验证基因序列正确.通过病毒包装技术,获得表达该片段的病毒株.经过病毒转染实验,获得表达CAR融合蛋白的稳转NK细胞株.PCR及Western blot证实,CAR融合蛋白在NK细胞表达.细胞杀伤实验证实CARNK细胞分泌细胞因子cd107a的能力明显优于对照组,具有明显的杀伤多发性骨髓瘤细胞的效应.结论:CAR能在体外构建并在NK92细胞表面表达,CARNK细胞能杀伤表达CD138抗原的多发性骨髓瘤细胞株,从而发挥抗骨髓瘤效应.
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多发性骨髓瘤相关抗原的免疫学筛选及生物信息学分析
本研究采用"cDNA表达文库的血清学分析(serological analysis of cDNA expression library,SEREX)"技术筛选骨髓瘤HMy2细胞cDNA表达文库.将得到的30个阳性克隆全部进行测序,并进行BLAST同源序列比对分析.结果表明:获得已知基因6条,骨髓瘤相关肿瘤抗原新基因12条.经部分序列EST拼接,已知基因6条如环指蛋白167、KLF10因子、TPT1蛋白、p02蛋白、cDNA FLJ46859 fis、DNMT1甲基转移酶等,它们与其他肿瘤的形成、发展与预后有一定的关系.利用生物信息学对新基因结构和功能初步分析和预测显示,其中MMSA-3、MMSA-8和MMSA-11有完整的编码区,编码的蛋白长度分别为215、160和122个氨基酸;除MMSA-1可能定位于性染色体,其余均可能定位于常染色体;MMSA-4和控制转录的肿瘤蛋白高度相似,MMSA-5可能参与细胞的吞噬作用,MMSA-7可能使NF-κB失活,MMSA-12可能为淋巴细胞的胞质蛋白.CrELISA初步分析表明,MMSA-3和MMSA-7等新基因特异性较高.结论:本项研究所筛选和鉴定的肿瘤抗原可用于多发性骨髓瘤的早期免疫学诊断、残留病灶监测、判断预后及肿瘤疫苗制备等多种研究.
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肿瘤抗原的新概念及其在淋巴瘤和其他肿瘤免疫治疗中的重要性
人类恶性肿瘤自身抗原的表达可以激发肿瘤免疫反应,肿瘤抗原特异的免疫治疗的确可以导致肿瘤消退.目前用于肿瘤自身抗原鉴定的方法有许多,已经鉴定出了2 000余种自身肿瘤抗原.虽然已经发现了许多自身肿瘤抗原,但是肿瘤抗原特异的免疫治疗效果目前并不十分令人满意,为此需要不断完善选择这些自身肿瘤抗原的新的理论基础,获得更有效的自身肿瘤抗原进行临床治疗,改善肿瘤患者预后,使将来肿瘤的治愈成为可能.本文主要回顾了自身肿瘤抗原的发现、鉴定、临床作用及作用机理,并综述了一些关于自身肿瘤抗原的新理论新概念,以及其在未来肿瘤免疫治疗中的作用.
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特异性嵌合抗原受体的T细胞肿瘤免疫治疗相关专利申请状况分析与研发进展
1989年,Eshhar研究小组首次提出将针对肿瘤抗原单克隆抗体的可变区和T细胞受体(T cell receptor,TCR)的亚基融为一体,重定向T细胞的免疫反应.表达特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的T细胞以抗原依赖、非MHC限制的方式结合肿瘤抗原,启动并活化下游级联反应,特异性杀伤肿瘤[1].这一尝试开启了嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T immunotherapy)的序幕.该疗法的一般程序是将患者的免疫T细胞在体外通过生物技术改造,采用B细胞的抗体基因和T细胞表面受体基因结合,用载体导入患者的免疫T细胞,从而使T细胞具有靶向性,令其识别肿瘤细胞表面的抗原,然后把T细胞输回给患者,达到识别、杀死肿瘤细胞的治疗效果.
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弱酸洗脱提取的肿瘤抗原肽致敏的树突状细胞对CTL的体内外激活效应
目的 弱酸洗脱提取小鼠红白血病细胞膜表面肿瘤抗原肽,用于致敏树突状细胞(dendritic cells,DC),观察其对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的体内外激活效应.方法 以pH3.3的枸橼酸-磷酸盐缓冲液室温下处理FBL-3小鼠红白血病细胞5 min,流式细胞术检测洗脱效率;弱酸洗脱的抗原肽经SepPak C18柱提取纯化,用于致敏DC,检测其体外刺激CTL细胞株增殖的能力及体内激发特异性抗肿瘤免疫应答的能力.结果 弱酸可以洗脱肿瘤细胞膜表面绝大部分与MHCⅠ类分子结合的抗原肽;经此抗原肽致敏的DC,体外可以激发特异性识别FBL-3细胞抗原九肽CCLCLTVFL的CD8+CTL细胞株增殖,回输小鼠,可以诱导体内生成高水平的特异性CTL活性,使小鼠获得抵抗后继FBL-3细胞攻击的免疫保护能力,并显著高于肿瘤冻融抗原致敏的DC回输组.结论 弱酸可以有效洗脱肿瘤细胞表面的Ⅰ类抗原肽,该类多肽致敏的DC,在体内外均可激活CTL,有效地诱导特异性抗肿瘤免疫功能.
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液-质联用分析肝癌细胞HLA-A2类分子递呈的抗原肽
目的寻找MHCⅠ类分子递呈的、T淋巴细胞识别的肝癌抗原肽. 方法人肝癌细胞系hHCC以枸橼酸-磷酸盐(pH3.3)液洗脱,洗脱物经粗分离,得到相对分子质量(Mr)＜5?000的各种多肽组分混合液;取各组分多肽分离液分别与抗原加工缺陷细胞(T2,HLA-A2)进行细胞表位重建,加入特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),51Cr释放法测杀伤活性;选活性值高的抗原肽组分进行反相高效液相色谱-质谱(RP-HPLC-MS)检测,对活性峰手工读谱分析其一级结构;后进行氨基酸同源性分析. 结果酸洗1010hHCC细胞,样品蛋白质浓度2mg/ml;通过RP-HPLC-MS检测,其质谱图经手工解析,氨基酸序列为SXXVHXNEV,X=1或L;氨基酸同源性分析证明SXXVHXNEV为SLIVHLNEV,是肝细胞生长因子受体的第1?075～1?083肽段,第1?080位点发生突变,由F变为L,由HLA-A2分子递呈. 结论细胞膜温和酸洗技术结合RP-HPLC-MS联用技术,是寻找肝癌抗原肽的有效方法,尚未见相同研究报道.发现的肝癌抗原肽SLIVHLNEV是肝细胞生长因子受体的突变物,可能具有重要生物学意义.
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肿瘤抗原MAGE-A:潜在的肿瘤标志物
黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene,MAGE)家族是肿瘤相关抗原,包括60多个家族成员.基于组织特异性表达和基因结构的不同,M AGE家族被分成两个大的子家族,MAGE-Ⅰ和MAGE-Ⅱ.MAGE-Ⅰ包含MAGE-A,MAGE-B和MAGE-C亚家族,在多种癌组织中高表达,并且在肿瘤发生和生长方面起重要的作用[1].MAGE-Ⅱ包括MAGE-D亚家族,其在正常人体内普遍表达.MAGE-A肿瘤相关抗原在极少的正常组织巾表达,典型的包括精原细胞、胸腺、胚胎.
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肿瘤微环境在肿瘤治疗中的作用及研究进展
肿瘤微环境是由肿瘤细胞及其所赖以生存的场所组成，包括肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关纤维细胞、髓源性抑制细胞、肥大细胞以及血管生成因子、细胞因子等，参与肿瘤的发生、进展、侵袭和转移等多个步骤，因此除了传统的治疗方式，研究肿瘤微环境是肿瘤治疗的一种新的探索方式。由于细胞外基质水平与化疗临床反应率呈负相关，表明肿瘤微环境作为肿瘤的“土壤”，与肿瘤进展和转移之间有重要关系，靶向188肿瘤微环境的治疗正在逐步成为研究热点，包括以新生血管为靶标的肿瘤治疗，肿瘤免疫疗法和逆转耐药的肿瘤增敏治疗。 Arjan W等近日经研究发现半乳凝素-1、半乳凝素-3、半乳凝素-8、半乳凝素-9均参与肿瘤新生血管内皮细胞的形成和相互连接，使得半乳凝素成为治疗肿瘤治疗的潜在靶点；Ralph M. Steinman于2011年因“发现树突状细胞及其在获得性免疫中的作用”获得了诺贝尔生理学或医学奖，使其成治疗恶性肿瘤的新的突破，目前树突状细胞免疫治疗已经用于200多项关于各项肿瘤的研究之中，此外，还可以通过给患者体内导入肿瘤抗原来激发患者的特异性抗肿瘤免疫反应，由于疫苗治疗具有特异性，在体内免疫效应维持时间长等优点，因此也成为研究热点；细胞外酸化的肿瘤微环境对肿瘤化疗产生关键影响，主要体现在对化学治疗药物的耐受，质子泵可以有效改善细胞外酸化进行逆转耐药的肿瘤增敏治疗，给肿瘤患者带来了一线曙光。
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高强度聚焦超声制备树突状细胞瘤苗对BALB/c小鼠肿瘤主动免疫的实验研究
目的 探讨采用高强度聚焦超声(HIFU)制备肿瘤抗原致敏树突状细胞(DC)对正常BALB/c小鼠肿瘤的主动免疫作用.方法 采用功率1000 W/cm2的HIFU辐照CT-26结肠癌细胞30 s,获取肿瘤抗原,与体外培养扩增第5天的DC共孵育,制备DC瘤苗.HIFU辐照法制备的DC瘤苗(HIFU组)一次性免疫正常BALB/c小鼠,7 d后再皮下接种活的CT-26结肠癌细胞,然后观察肿瘤发生时间、20 d时瘤体重量和体积、小鼠生存时间等.并设立反复冻融法致敏DC组(冻融组)和生理盐水对照组(对照组),比较各组瘤体重量和体积、小鼠生存时间是否有差异.结果 HIFU组、冻融组与对照组比较肿瘤发生时间、20 d瘤体重量和体积、小鼠中位生存时间等差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05).HIFU组与冻融组比较瘤体重量、体积及小鼠中位生存时间差异亦有统计学意义(P＜0.05).结论 HIFU辐照法制备的DC瘤苗对小鼠肿瘤的发生有一定的主动免疫作用,并优于反复冻融法制备的DC瘤苗.
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高强度聚焦超声制备肿瘤抗原致敏树突状细胞及其体外诱导T细胞产生IFN-γ的研究
目的探讨采用高强度聚焦超声(HIFU)辐照肿瘤细胞制备肿瘤抗原致敏树突状细胞(DC)和制备DC肿瘤疫苗的可行性.方法 (1)采用1 ng/ml IL-4和10 ng/ml GM-CSF联合诱导小鼠骨髓细胞产生DC,并用流式细胞仪检测DC的CD80、CD86、H-2Kd和I-Ad表达情况;(2)固定辐照时间或超声声强,应用不同声强或辐照时间的HIFU辐照CT26细胞株后,用台盼蓝染色、MTT法检测活肿瘤细胞数,同时用台盼蓝染色观察肿瘤细胞的形态学变化,分析HIFU剂量与肿瘤细胞存活率的关系,了解剂量-效应关系;(3)固定辐照时间和超声强度,HIFU辐照CT26细胞悬液,制备肿瘤细胞抗原并致敏DC,致敏DC与T细胞共孵育48 h后提取上清液,通过ELISA法检测上清中IL-12、γ干扰素(IFN-γ)的含量,并与冻融组、单纯CT26、对照组进行比较.结果 (1)采用IL-4和GM-CSF联合诱导小鼠骨髓细胞可培养出典型的DC;(2)固定辐照时间,随着HIFU辐照剂量的增加肿瘤细胞的存活率迅速减少,肿瘤细胞的碎片逐渐增多,当声强为1000 W/cm2,辐照30 s时,无细胞存活,肿瘤细胞失去正常形态,全部被撕裂成碎片;(3)通过ELISA法检测HIFU、冻融及单纯CT26组上清液中IL-12、IFN-γ的含量显著高于对照组(P均＜0.05),HIFU及冻融组上清液中IL-12、IFN-γ的含量高于单纯CT26组(P均＜0.05),但HIFU、冻融组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HIFU能灭活肿瘤细胞并能使肿瘤细胞破碎,HIFU制备的肿瘤抗原可体外致敏DC,并可使DC成熟分泌大量IL-12,同时诱导T细胞分泌大量IFN-γ.
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高强度聚焦超声制备抗原致敏树突状细胞及其诱导细胞毒性T淋巴细胞杀伤效应的研究
目的 探讨高强度聚焦超声(HIFU)制备抗原致敏树突状细胞(DC)及其诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤效应.方法 应用小鼠重组GM-CSF和IL-4培养小鼠骨髓DC,用HIFU制备CT26肿瘤细胞抗原致敏DC疫苗,用3H-TdR法检测T细胞增殖反应的能力,标准的4 h 51Cr 释放测定法检测CTL杀伤活性.结果 HIFU组、肿瘤细胞冻融组、肿瘤上清组和PBS组的DC在体外均可以诱导CTL增殖,但HIFU组、肿瘤细胞冻融组的DC体外诱导CTL增殖能力明显高于肿瘤上清组和PBS组(P＜0.05).HIFU组和肿瘤细胞冻融组DC体外诱导的CTL对CT26结肠癌均有明显的细胞毒性作用,与肿瘤上清组DC和PBS组比较差异有统计学意义(P＜0.05),HIFU组体外诱导的CTL杀伤活性与肿瘤细胞冻融组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HIFU制备抗原致敏DC可以诱导CTL大量增殖,并能诱导出杀伤效应较强的CTL.
