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基因芯片在传染病分子流行病学中的应用
基因芯片是指固定有许多有序列的寡核苷酸探针的载体,通过杂交检测,对各种基因进行分析[1].由于它所具有的高通量性、快捷、便宜等优点,在各个领域起着越来越重要的作用,其中也包括分子流行病学领域.基因芯片主要用于菌株的地理流行病学分析、菌株的重要分子特征相关的流行病学分析--分子流行病学的病因学研究及传染病的诊断与鉴别诊断.本文主要从芯片的原理、应用及所存在问题等几方面,初步探讨基因芯片在传染病流行病学应用中的广阔前景.
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生物芯片技术在中药鉴定研究中的应用与展望
本文在概述了生物芯片技术的基础上,就该技术初步探讨并展望了基因芯片技术在中药鉴定中的应用.
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荧光定量与芯片杂交快速诊断患儿化脓性脑膜炎
临床确诊化脓性脑膜炎(化脓)主要依赖脑脊液细菌培养,但其耗时较长,阳性率低,难以适应临床早期诊断.为此,我们对疑似化脑患儿行脑脊液细菌DNA荧光定量及芯片杂交检测,并进行脑脊液细菌培养对照,效果较好.
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定量聚合酶链反应技术及在临床实验室应用的价值
随着分子生物学技术的发展,聚合酶链反应(PCR)技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方面的诊断,如检测临床标本中病原体核酸序列、肿瘤基因突变情况、遗传性疾病的基因序列、人类白细胞表面抗原(HLA)配型、法医学方面的鉴定工作等。目前基因芯片的问世,将分子生物学技术又推向一个新的高潮。现就临床实验室开展PCR技术及PCR技术检测病原微生物及肿瘤基因的临床意义和定量PCR技术,谈谈我们的看法。 1.目前国内临床实验室应用PCR技术存在的问题:在设施方面,如仪器显示的温度与孔内的温度不一致,有孔内差;自动化程度较低,人工操作人为误差较大;实验室布局不合理,不能满足3个分开的房间进行分阶段操作(第1间实验室为混合试剂和质控,第2间实验室为标本提取和试剂混合,第3间实验室为PCR扩增及产物检测,工作人员应从第1间依次到第3间实验室,不能返回工作。室内空气流向依次从第1间到第3间实验室,不能逆流,以防止空气污染);加样器及试剂等容易污染导致假阳性。另外,标本采集及保存不合适和操作不当易出现假阴性。例如检测痰中结核杆菌,标本采集一定是痰而不是唾液。血清中检测HCV-RNA标本保存不当,使病原体被破坏.操作者不戴手套或说话唾液溅入标本,RNA降解,失去PCR的模板,造成假阴性结果。合理设计寡核苷酸序列,好在保守区,特异性强,无干扰。 琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR产物的影响因素较多。如模板量大则拖尾现象严重,非特异性干扰带多。结果难于清楚判断。标本中有抑制物(Hb,高浓度尿素)均可出现假阴性。 目前美国病理学会(CAP)等组织以及临床实验室改进修正案(CLIA 1988)要求正规检测方法是先行PCR扩增,然后进行杂交来判断结果。但美国一些实验室,如印第安纳大学医学中心的病理和医学实验室用PCR方法检测临床标本中乙肝病毒(HBV)、EB病毒(EBV)、人巨细胞病毒(CMV)的DNA。他们认为在他们的实验室里,用琼脂糖凝胶电泳和电泳后再杂交的两种判断结果是一致的。因为他们实验室条件非常严格,而且每年都要通过美国CAP检查。但仍有些检测项目未得到美国FDA的批准。 2 .PCR技术检测的临床意义:我们认为对灵敏度和特异性基本上达到临床需要的检测技术,不必一律采用PCR技术。目前没有其他诊断技术可以检测的疾病,如基因缺失、易位、突变及病原体需要较长时间培养或培养难度较大的疾病应考虑用PCR方法。如人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种慢性病毒,在细胞内的繁殖水平比较低,感染后潜伏期较长,病毒难以培养而且需要较长时间培养。在对HIV抗原(HIV-Ag)和抗体(HIV-Ab)的检测结果难以判断时,可用PCR技术作为确认手段。当前临床标本一般仅检测HIV-Ab。在美国,血液制品既检测HIV-Ab也检测HIV-P24Ag 。国外有学者报道,感染HIV的患者血清HIV-P24Ag出现早于HIV-Ab10天左右。发现HIV-P24Ag(+)者,HIV PCR(+)。但HIV PCR(+)者,HIV- P24Ag可呈现(-),此时患者已具有传染性。PCR技术可用于艾滋病的早期诊断,定量PCR技术还是艾滋病疗效观察的有效检测手段。 用PCR和杂交方法对HCV基因分型、早期诊断和治疗监测均具有较大的临床意义,这已被国内外医学界的工作者公认。 结核分枝杆菌(MTB)培养时间一般要30~50天,培养出来的分枝杆菌还要鉴定是人型还是鸟型。涂片检查所需的抗酸杆菌也要一定的浓度。因此可以采用PCR方法检测。但PCR技术不能完全取代结核杆菌培养。PCR在药敏结果判断方面亦不理想。 当前有检测沙眼衣原体抗原的试剂盒,特异性高,但敏感性不甚满意。衣原体需在细胞中培养后进行鉴定,对临床常规检验工作有一定的难度。应用PCR技术检测沙眼衣原体有一定的临床意义。 美国FDA已批准HIV、MTB、沙眼衣原体的PCR或杂交检测试剂盒。也批准了HPV的过筛检测,对于HPV各型的检测,目前尚未批准。MTB的靶序列是16 s DNA的584bp。其后带用杂交检测。沙眼衣原体的检测试剂盒于1993年通过FDA批准,目前用特殊探针进行杂交后用免疫化学法检测。
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基因表达谱芯片筛选瘢痕疙瘩差异表达基因
目的:瘢痕疙瘩是皮肤真皮伤愈合后遗留的高出周围皮肤、发红、坚硬的病理结构.患者不仅有瘙痒、刺痛等症状,关节部位瘢痕挛缩常限制肢体的功能活动,在面部等暴露部位还可导致毁容,从而严重影响患者的身心健康和受损部位的功能恢复,成为影响严重烧、创伤病人康复的一大难题.从分子水平了解瘢痕疙瘩发生机制,将为治疗这一病症提供可靠的线索,因此本课题探讨与瘢痕疙瘩发生相关基因群的表达变化,并对部分基因的功能进行初步分析.方法:按一步法抽提瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的总RNA并纯化mRNA将8464条人类基因PCR产物按微阵矩排列点样于化学涂层的载玻片上,制成基因芯片.将等量的瘢痕疙瘩和正常皮肤的mRNA分别逆转录合成荧光分子(Cy5或Cy3)掺入的cDNA一链做探针,混合后与上述基因芯片杂交.经严格洗片后扫描芯片荧光信号图像,计算机分析后比较两种组织中差异表达的基因.通过RT-PCR技术和Northern杂交检测TGF-β1和c-myc基因在不同组织中的表达变化.结果:在8464种基因中,瘢痕疙瘩和患者自身正常皮肤组织间存在差异表达基因,在所测的3对临床标本中共有差异表达基因436条.根据这些基因表达蛋白的结构和功能,可以分为15类,如:癌基因和抑癌基因,运输蛋白基因,细胞信号和传导蛋白基因,细胞应急蛋白基因,与细胞骨架和运动相关的蛋白基因,细胞凋亡蛋白基因等,其中上调基因有282条(3.33%),包括TGFβ1和c-myc基因;下调基因有154条(1.82%).RT-PCR和Northern杂交方法证实,瘢痕疙瘩内TGFβ1和c-myc的mRNA含量都明显高于正常皮肤.结论:瘢痕疙瘩的发生是一个复杂的过程,多种基因表达的变化与其形成相关.微阵矩基因芯片在筛选瘢痕发生相关基因的改变时,具有快速、高通量和高敏感等特点,瘢痕疙瘩差异表达谱的分析为治疗瘢痕提供了新的思路和线索.
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程序性细胞死亡因子4在大肠癌组织中表达的临床病理学意义及其与预后的关系
程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)是一个新发现的与细胞周期及凋亡相关的抑癌基因.本研究应用免疫组化和Western blot印迹杂交检测PDCD4蛋白在大肠癌组织中的表达,探讨其与肿瘤的分化程度、病理分期等临床病理学参数之间的关系及其对预后的影响.
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85例支原体肺炎核酸分子杂交检测结果报告
支原体为临床引起原发性非典型性肺炎的一种重要病原体,晚近报告颇多,并有局部流行趋势[1].本病诊断长期依赖于血清抗体滴度测定及病原体分离培养等.但因存在耗时较久,检出阳性率颇低以及灵敏性和特异性欠佳等缺点,致使不能达到临床早期诊断的目的.
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PCR-酶标板杂交比色法检测结核分枝杆菌
目前在传染性疾病中,结核病仍然是主要致病和死亡原因之一,威胁公众健康.随着HIV蔓延,多重耐药菌株产生,以及世界人口流动增强,其发病率有上升趋势[1].MTB检测方法很多,其中以PCR方法较为灵敏.常规凝胶电泳检测PCR产物结果主观性强,存在溴化乙啶污染及非特异条带影响,膜相杂交检测虽然可提高特异性,但操作繁琐.本研究采用酶标板杂交比色法检测PCR产物,并取得了满意结果.
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乙型肝炎HBV DNA/补体双特异性免疫复合物的检测
HBV DNA/C1q-TCIC和HBV DNA/B-TCIC的阳性率年均以慢性乙型肝炎高.以羊抗人C1q和B因子IgG为捕提抗体,分别用以捕捉通过经典和旁路途径激活抗体的Dane颗粒抗原抗体免疫复合物中的C1q和B因子,再利用引物的特异性和PCR的强大扩增能力,对捕捉物中的HBVDNA进行微孔法反向杂交检测,时间短且效果明显,是一种快速检测手段.
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聚合酶链反应结合地高辛标记寡核苷酸杂交检测肠道致病菌的应用
16S rDNA是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列,既保守又相对,呈现出保守区和可变区交错排列的状态.根据这些特点,我们在16S rDNA保守区设计聚合酶链反应(PCR)引物,用一对通用引物在适宜的PCR反应条件下就可以将所有细菌的相应基因片段全部扩增出来,同时利用可变区设计地高辛标记的种特异性寡核苷酸探针与扩增产物进行斑点杂交而区分不同细菌.现报告如下.
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临床基因诊断实验室的管理
一技术背景在基因诊断技术发展史中核酸分子杂交发展早,于1961年开始研究.经典的方法是Southern印迹法,主要用于DNA的检测;随后又发展出了Northern印迹法(检测RNA)和斑点杂交法等.它是直接对样品中靶序列的测定.杂交法灵敏度不够,据报道敏感的核酸探针仅能检出103~104拷贝的靶分子,而多数临床标本中靶分子量远低于此限.1980年代中期,以PCR技术为主的体外核酸扩增技术的发展,使低拷贝临床标本的检测成为可能.PCR能使样品中靶序列的拷贝数特异性地快速扩增105~107倍,将检测阈值降至1~10拷贝数,大大提高了杂交检测的灵敏度.
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纳米银胶标记的DNA电化学传感器制备及应用
目的:研究一种新型的纳米银胶标记DNA电化学传感器的制备及应用.方法:通过将纳米银胶标记于人工合成的5'端-巯基修饰的寡聚核苷酸片段上,制成银胶DNA电化学探针.利用阳极溶出伏安法检测标记于DNA末端的Ag+,实现对特定序列DNA的测定.结果:经过实验条件的优化,测定DNA浓度在1.0×10-9-6.0×10-7mol/L范围内呈良好的线性关系,检测限为5.0×10-10 mol/L.结论:该DNA电化学传感器响应快速、灵敏度高、稳定性好,适合于生物分析.
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肽核酸相关技术在疾病诊断与治疗方面的应用
肽核酸(peptide nucleic acid;PNA)是一类不带电荷的类似于肽链的骨架结构,携带有碱基的新信息分子,该分子主链骨架是由单体N-(2-氨乙基)-甘氨酸间通过酰胺键反复连接而成的长链,侧链则是利用亚甲羰酰键将碱基与主链骨架相连而形成 [1,2] .PNA分子不含戊糖和磷酸基,故呈电中性,此电中性的存在赋予了其许多DNA或DNA类似物所不具有的性质,如高灵敏度、高特异性、非盐依赖性、高稳定性 [3] 等,使PNA分子作为一种优良的寡核苷酸取代物被广泛应用于分子生物学研究及相关领域成为必然,无疑将会成为一种优良的核苷酸取代物而应用于杂交检测、疾病治疗、反义核酸药物 [4] 等领域.本文就近年来PNA技术的研究在疾病诊断与治疗方面的应用作一综述.
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bcl-2在鸡马立克氏病肿瘤中的表达
目的:从mRNA水平测定bcl-2在鸡马立克氏病MD肿瘤中的表达,阐明bcl-2与MD淋巴瘤形成的关系.方法:用来克亨SPF鸡复制MD肿瘤模型,取肿瘤和相应正常组织,液氮保存,用AGPC(Acid Guanidiniun Thiocyanate-Phenol-Chloroform,一步法)法提取组织总RNA(TRNA),紫外测定其浓度,甲醛变性胶电泳观测其纯度.一个含鸡bcl-2 1.2 kb片段的质粒(pTTCB1),经转化扩增,提取质粒DNA,并用限制性内切酶(RE)消化,回收纯化bcl-2片段,放射性[α-32P]标记,制成探针,通过班点(Dot blot杂交和Northern blot分子杂交检测MD肿瘤组织中的bcl-2的表达情况,并与相应的正常组织比较.结果:①MD肿瘤组织和相应正常组织中均有bcl-2的表达;②MD肿瘤组织中bcl-2 mRNA的水平明显高于相应的正常组织.结论:bcl-2表达产物通过阻遏细胞凋亡促进MD淋巴瘤的形成.
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治疗鼻咽癌的新策略:抗独特型疫苗的主动免疫治疗
目的和方法:用两株具有鼻咽癌相关抗原内影像的抗独特型单克隆抗体2H4、5D3,经氢氧化铝凝胶沉淀法制备成抗独特型疫苗Alum-2H4、Alum-5D3,对19例晚期鼻咽癌放疗病人作主动免疫治疗,9例放疗加生理盐水注射为对照组.用ELISA检测治疗前后病人血清抗体和细胞因子水平.用原位Northern杂交检测外周血单个核细胞(PBMC)IL-2 mRNA的表达.
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卡介苗胞壁蛋白诱导人肺腺上皮细胞hBD-1 mRNA表达及其抗菌活性的增强
目的:旨在分离和鉴定刺激人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)β-防御素-1(hBD-1)基因表达的卡介苗胞壁活性蛋白,为开发增强粘膜抗菌肽基因表达的免疫增强剂以防治粘膜感染的研究打下基础.方法:采用超声破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、Sephadex G-150柱层析等方法分离卡介苗胞壁蛋白质组份;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Northern杂交检测SPC-A-1细胞hBD-1 mRNA的表达;采用琼脂糖弥散杀菌法检测SPC-A-1细胞培养上清的抗菌活性.结果:RT-PCR和Northern杂交分析均证实卡介苗刺激SPC-A-1细胞hBD-1 mRNA的表达增强了2倍.卡介苗胞壁蛋白Sephadex G-150层析所得6个组分中,组分5(分子量范围约21×104-29×104)诱导SPC-A-1细胞hBD-1 mRNA的表达增强4倍,其培养上清的抗菌活性显著增强.这种诱导作用具剂量和时间依赖关系.结论:结果提示卡介苗胞壁蛋白是β-防御素基因诱导表达的一新的激活因子.
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核酸杂交检测HBV前C区变异
我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高发区,大约有50%左右的人群受过HBV的感染.近年来发现,HBV感染后临床产生的不同疾病谱与病毒本身密切相关[1],因此, HBV前C区基因变异被广泛研究.整合在肝细胞染色体中的HBV-DNA拷贝数较少,并且常常出现基因片段的丢失,不易被常规方法检测出来.本文报道核酸杂交法检测HBV前C区基因变异的方法及结果.
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诱导人肺腺上皮细胞hBD-1基因表达的BCG胞壁蛋白
目的:分离和鉴定增强人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)抗菌活性核β-防御素-1(hBD-1)基因表达的菌种及其有效成份,为开发增强粘膜抗菌肽基因表达的免疫增强剂以防治粘膜感染的研究打下基础.方法:采用超声波破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、Sephadex G-150柱层析等方法分离卡介苗胞壁蛋白质组份;采用琼脂糖弥散杀菌法检测SPC-A-1细胞培养上清的抗菌活性;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和North-em杂交检测SPC-A-1细胞hBD-1 mRNA的表达.
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卡介苗胞壁蛋白增强人肺腺上皮细胞hBD-1mRNA的表达及抗菌活性
目的:分离和鉴定增强人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)抗菌活性核β-防御素-1(hBD-1)基因表达的菌种及其有效成份,为开发增强粘膜抗菌肽基因表达的免疫增强剂以防治粘膜感染的研究打下基础.方法:采用超声波破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、SephadesG-150柱层析等方法分离卡介苗胞壁蛋白质组份:采用琼脂糖弥散杀菌法检测SPC-A-1细胞培养上清的抗菌性;应用逆转录聚合酶链反庆(RT-PCR)法和Northern杂交检测SPC-A-1细胞hBD-1 mRNA的表达.结果:利用RT-PCR和Northern杂交分析,证实了卡介苗诱导SPC-A-1细胞hBD-1 mRNA的2倍增强表达.
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双岐杆菌胞壁蛋白诱导人肠上皮细胞β-防御素-2基因的表达及NF-κB的活化
本研究应用超声破碎和离心法分离获得双岐杆菌胞壁,2%SDS提取其胞壁蛋白,superdex-200柱层析获得多个蛋白组分.RT-PCR和Northern杂交检测到双岐杆菌全菌、胞壁、胞蛋白均可诱导人肠上皮细胞株HT-29 and Caco-2细胞表达人β-防御素-2(HBD-2)mRNA的显著表达.为了在蛋白质水平上检测其基因的增强表达,构建了HBD-2基因原核表达载体,并制备获得其重组制品的多克隆抗体,ELISA、Western blot和免疫细胞化学等技术均检测到双岐杆菌胞壁组分可刺激肠上皮细胞高效表达HBD-2.P65免疫细胞化学染色检测到在双岐杆菌胞壁蛋白刺激下NF-κB向细胞核移位,IκB和磷酸化IκBwestern blot检测到IκB发生磷酸化和降解,表明基因转录因子NF-κB的活化,提示双岐杆菌胞壁蛋白信号可能通过NF-κB信号转导通路诱导肠上皮细胞β-防御素-2基因的表达.