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乙型脑炎病毒高株部分基因序列分析
乙型脑炎病毒(JEV)高顺生株(高株)是我国学者于60年代从病人脑内分离到的乙脑病毒野毒株,其血凝活性的pH值较宽,与其他乙脑毒株不同,国内外对高株分子生物学研究尚未开展。我们对高株这两段基因保守区进行了DNA序列分析,以初步了解高株与其他乙脑野毒株基因序列的不同,为进一步阐明高株基因组结构与功能的关系奠定基础。 1 材料和方法 1.1 病毒的培养将中国预防医学科学院病毒学研究所虫媒病毒研究室冻存的感染高顺生野毒株的鼠脑在无菌状态下仔细研磨,离心取上清,10倍稀释后接种单层BHK细胞,数天后出现典型细胞病变(CPE)。
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介绍沙门菌的新命名系统
DNA分子生物学技术,特别是各种实时PCR技术、现代DNA测序的发展和应用,豁然明白了沙门菌属(Salmonella)的各个种、亚种、型的精确关系,例如过去认为是种的伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、副伤寒A和B沙门氏菌、肠炎沙门菌在保守区某片段处只有几个核苷酸差别,即它们不是种、也不是亚种的关系,而属于型的差异 [1].故需要更改沙门菌属的分类和命名.
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黏附素保守区疫苗防治鼠幽门螺杆菌感染
目的:利用人类幽门螺杆菌(Hpylon)感染的小鼠模型研究黏附素保守区(AB)疫苗在预防与治疗Hpylon感染的作用.方法:实验分为预防与治疗两部分.预防部分把实验动物无特定致病菌C57BL/6小白鼠分成4组,分别通过灌胃方法给予AB(100μg)加CT(2.μg)、生理盐水、单纯AB(100μg)、单纯CT(2μg),1次/wk,共4次.2 wk后再用活Hpylori灌胃,再4 wk后处死动物.治疗部分把已感染H pylori的小白鼠分成4组,分组与治疗方法同预防部分,治疗结束后4 wk处死动物,取胃黏膜行半定量细菌培养检查H pylori情况.结果:预防实验的保护率分别为AB加CT61.5%(16/26),单纯AB、单纯CT和PBS保护率均为0.AB加CT治疗组H pylori根除率为:38.5%(10/26),生理盐水组、单纯AB、单纯CT组均无治疗作用.治疗组未根除H pylori的小鼠,疫苗组H pylori的定植密度明显低于其他4组(P<0.05).结论:由AB加免疫佐剂组成的口服疫苗,不仅有预防H pylori感染的作用,同时也有根除已感染的H pylori的作用.AB可用于Hpylori疫苗的研制.
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含变链菌PAc蛋白编码基因保守区重组质粒pCIA-P的亚克隆构建
人类致龋菌变形链球菌(S.mutans)的一种表面蛋白PAc,由于参与介导细菌对牙面的粘附而被视作S.mutans的重要毒力因子,因此成为研制防龋疫苗的主要备选抗原.我们选择pac基因中编码PAc主要免疫活性区域的DNA序列, 制备出待表达DNA片段, 经亚克隆至pGEM-T质粒后,再克隆到高效哺乳动物表达质粒pCI中构建成含pac基因重要抗原决定簇编码区域的重组质粒,从而为防龋DNA疫苗的免疫实验研究完成了重要准备.
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聚合酶链反应诊断新生儿化脓性脑膜炎的临床价值探讨
本文对18例疑似新生儿化脓性脑膜炎(简称化脑)的脑脊液标本,用细菌核糖体小亚基核糖核酸(16S rRNA)相对应基因的高度保守区引物进行PCR,检测脑脊液中是否存在细菌DNA,以探索一种快速判断颅内细菌感染的分子生物学诊断方法,现报告如下.
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糖苷水解酶第10家族真菌木聚糖酶保守区及进化关系的分析
目的 对糖苷水解酶第10家族(glucoside hydrolase family 10,GHF10)真菌木聚糖酶保守区及进化关系进行分析.方法 应用CLUSTALW2软件对41条GHF10真菌木聚糖酶氨基酸序列进行多序列比对分析,获得完全保守的氨基酸位点;应用Block Maker和Consensus软件对CLUSTALW2比对结果进一步分析,确定第10家族真菌木聚糖酶共有的保守区及保守氨基酸位点;应用Pymol软件对源于GenBank中登录的6种10家族木聚糖酶进行比对,并找到这41条序列中共有的β折叠和α螺旋;利用MEGA 4.0软件对CLUSTALW2比对结果构建系统进化树,并根据进化树进行分组.结果 41条序列长度虽然不等,但均包含E270和E405两个谷氨酸催化位点.通过序列比对,得到第10家族真菌木聚糖酶的5个高度保守区TPENSMK、RGHTLVWHSQLPSWV、WDVVEN、AKLYINDYYNL、TELDI以及20个完全保守的氨基酸位点,这些保守区和保守位点多数分布在木聚糖催化区域以及(β/α)8折叠桶的内壁上.根据木聚糖酶的亲缘关系,可将第10家族真菌木聚糖酶分为3个大组,其中第1和第3组的木聚糖酶分别有12和27种,且均来源于子囊菌门;第2组仅包含2种木聚糖酶序列,来源于Neocallimastigomycota和担子菌门.结论 分析了GHF10真菌木聚糖酶的保守区及进化关系,为木聚糖酶的工程改造奠定了基础.
关键词: 糖苷水解酶第10家族 真菌 木聚糖酶 保守区 进化 -
云南省不同地区恶性疟原虫MSA-I、MSA-2和Pf60.1基因多态性研究
裂殖子表面抗原MSA-l和MSA-2是编码裂殖子表面抗原的多基因家簇.有大量的保守区和可变区.这个基因被认为与恶性疟原虫的入侵,保护性免疫和免疫逃避有关.研究表明该基因在高疟区、低疟区及在不同的疟疾季节性传播中表现出多态性1-3.为了解在云南不同疟疾流行区的恶性疟原虫中该基因的多态性特征,以便对云南省疟疾有深入的认识.进行了探索性调查.
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聚合酶链反应结合地高辛标记寡核苷酸杂交检测肠道致病菌的应用
16S rDNA是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列,既保守又相对,呈现出保守区和可变区交错排列的状态.根据这些特点,我们在16S rDNA保守区设计聚合酶链反应(PCR)引物,用一对通用引物在适宜的PCR反应条件下就可以将所有细菌的相应基因片段全部扩增出来,同时利用可变区设计地高辛标记的种特异性寡核苷酸探针与扩增产物进行斑点杂交而区分不同细菌.现报告如下.
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拉米夫定耐药者HBV P基因rtL180M和rtM204V/I突变分析
拉米夫定(Lamivudine)等核苷类似药物已广泛应用于慢性乙型肝炎患者的抗病毒治疗,它能抑制HBV复制中的逆转录过程,显著降低HBV DNA载量.但长期使用会引起HBV多聚酶基因RT保守区发生点突变并导致临床耐药.我们对141例拉米夫定临床耐药者和60例未经拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者血清HBV P基因序列进行了分析,以探明突变发生频率以及与耐药可能存在的相互关系.现报告如下.
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应用核糖体及其内转录间隔区基因同源性分析鉴定致病性真菌
近年来随着广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛应用,以及肿瘤、器官移植等免疫低下人群的不断增多,念珠菌、隐球菌等深部真菌感染的发生率呈现明显上升趋势.一些新的致病性真菌或真菌的新特性也在不断地被认识,而对致病性真菌的鉴定则是其认识的基础与关键[1].我们应用真菌核糖体保守区及其内转录第2间隔区基因(ITS2)序列同源性分析,为致病性真菌的分子鉴定提供一个客观依据.
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16SrDNA序列分析技术在临床细菌鉴定中的应用进展
传统的细菌系统分类的主要依据足形态特征和生化反应,对于有些疑难菌、少见菌的鉴定往往雄以达到理想的鉴定效果二近代分子遗传学和分子生物学实验技术的迅猛发展使微生物学的分子鉴定成为了可能,其中包括G+C mol%含量测定、16SrRNA基因(16SrDNA)和16 ~ 23SrRNA基因序列分析等.原核生物16SrDNA是编码16SrRNA的基因部分,具有种属保守性.本文就16SrDNA序列分析技术在临床细菌鉴定巾的应用进展作一综述.1.16SrDNA的分子结构与特点细菌16SrDNA存在于所有细菌的染色体基因组,其特点为:(1)以多拷贝形式存在于细菌基因组中.(2)由可变区和保守区组成,保守区为所有细菌共有.可变区具有属或种的特异性,可据此进行引物和探针的设计.(3)其为长度适巾的1542bpDNA序列[1].由于16SrDNA与细菌整个基因组相比,有高度的保守性且具有良好的时钟性质,有人将其称为细菌的"化石".同时几乎所有病原菌的16SrDNA测序均已完成,因此16SrDNA被选为细菌鉴定的新目标[2-3].
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TTVDNA在肝细胞中的表达及其致病性研究
1997年12月日本学者Nishizawa等先从一例输血后非甲非庚型肝炎患者血清中分离到一种DNA病毒克隆(N22),命名为TT病毒(transfusion transmitted virus,TTV).并报道感染TTV后表现为一过性或持续性病毒血症,且病毒滴度与ALT升高相关,推测TTV可能是未知病毒致肝损害的病因之一[1].为探讨这一新型病毒在肝组织中的表达与分布特点,我们在TTV ORFl的保守区设计一对引物,采用PCR扩增法,以地高辛标记TTVORFl部分基因序列(1914-2186nt),获得双链TTV DNA探针.用此探针对部分肝病患者肝组织TTV DNA进行原位杂交检测,并对其中一株TTV ORFl部分基因进行分子克隆与核苷酸序列分析,现报道如下.
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针对芳烃双加氧酶保守区的聚合酶链式反应研究
芳烃双加氧酶是芳环类污染物在微生物降解途径中发挥起始作用的关键酶.本研究通过对数据库中的双加氧酶序列进行序列比对,发现并选取其中的主要保守区序列.聚类分析表明该保守区能够代表全长序列的聚类信息.通过对应该序列设计的聚合酶链式反应引物,能够从土壤分离的降解菌中扩增相应的基因产物.测序及聚类结果揭示,除传统的nahAc基因类型外,phnA1a和phnA1b是新的广泛存在于鞘氨醇单胞菌属细菌中的双加氧酶基因类型.
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食管癌组织中HPV16型L2线性抗原基因的克隆及原核表达
[张菊,阎小君,严泉剑,段杰,侯瑜,苏成芝.世界华人消化杂志,2001;9(3):273-278]目的通过聚合酶链方法,以特异引物,从感染人乳头瘤病毒的新鲜食管癌组织获得人乳头瘤病毒1 6型晚期表达基因I2保守区线性抗原片段的基因,并体外表达,获得具有抗原活性的原核表达蛋白,以探索研制低廉,方便及准确的人乳头瘤病毒感染的新型诊断试剂.方法在前人研究的基础上,经计算机检索,选定与食管癌高度相关的人乳头瘤病毒16型晚期表达基因L2N端的一段基因,采用特异引物及聚合酶链方法从多例人乳头瘤病毒感染的食管癌组织DNA模板中,获得人乳头瘤病毒16型晚期表达基因L2保守区线性抗原片段的基因,经克隆入测序载体验证DNA大小及序列后,将HPV16 L2 DNA保守区线性抗原基因片段克隆入高效原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,初步以Western-blot测定表达产物的抗原性:与乳头瘤病毒抗体及感染者血清的反应活性.结果以我们设计的特异引物,从两例人乳头瘤病毒感染阳性的食管癌组织DNA模板中以得到预期大小的PCR产物,并能插入预定的克隆载体中测序,所得基因的序列符合目的基因的序列,且两例组织所得的目的DNA序列完全一致,其插入大肠杆菌表达载体能获得表达,且表达产物具有抗原活性,能与商品化的乳头瘤病毒抗体及乳头瘤病毒感染患者的血清发生抗原抗体反应.结论从食管癌组织中能检出人乳头瘤病毒HPV16型晚期表达基因区L2特定片段的基因,该片段确具高度保守性.在大肠杆菌中表达此片段所获得的表达产物,有抗原活性,有望用于流行病学检查,预警人乳头瘤病毒感染相关的癌症发生. (潘伯荣)
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食管鳞状上皮细胞癌及癌旁组织中HPV11 L1基因克隆及序列比较
[马群风,江 红,刘 锟,冯永强,周勇安,王小平,李谨瑜. 细胞 与分子免疫学杂志,2001;17(3):251-254] 目的 克隆食管癌组织和癌旁组织中HPV11型主要壳蛋白L1基因,并比 较两个序列间的同源性. 方法 以食管癌组织和癌旁组织纯化的总DNA为模 板,根据HPV11型L1基因的保守区分段设计引物. 分两段扩增HPV L1基因,克隆入质粒载体 中,pGEM-3Zf(-)以双脱氧法双向测定目的片段的序列,并拼接出该片段的全序列,比较两 个序列间的同源性,以及与已知基因序列的差异性. 结果 从1例食管癌患 者食管癌组织和癌旁组织中,分别克隆到1株HPV11型L1的编码序列M1和M2,两序列间的同源 性极高,仅在个别位点存在差异. 与GenBank中登录的HPV序列NC001525.1(HPV-11), M1411 9.1(HPV-11)和AF217526.1(HPV-11)相比较大部分相同. 结论 成功地构 建了HPV11型L1基因上游片段pGEM-3Zf(-)和下游片段pGEM-3Zf(-)的重组克隆,为深入研 究HPV的感染与食管癌发病机制的关系奠定了基础.(井晓梅)