首页 > 文献资料
-
构象敏感凝胶电泳快速检测HBV准种序列异质性的方法
目的:建立一种快速检测乙型肝炎病毒(HBV)准种遗传异质性的方法并验证其敏感性和特异性.以满足研究HBV准种需要检测大量病毒序列的要求.方法:在构象敏感凝胶电泳(CSGE)检测方法的基础上,针对HBV核酸序列组成的特殊性,调整凝胶中使用的甲酰胺和乙二醇浓度并加入一定量的尿素,另外通过一次预电泳优选驱动序列.后用改进地CSGE检测已知序列的HBV C-ORF区片段克隆,并把检测结果与DNA序列分析结果进行比对,验证该方法的敏感性和特异性.结果:用改进地CSGE检测克隆的HVC C-ORF区片段获得了清楚地电泳图谱.对已知序列的HBC C-ORF区克隆片段进行检测:在34个克隆中发现了27种不同的克隆型,准种内病毒株(克隆)频率介于2.9~17.6%,克隆型之间的遗传距离介于0.2~2%.CSGE所得结果与DNA序列分析结果高度一致.结论:我们建立的CSGE具有高度的敏感性和特异性,完全可以用于检测HBV准种序列的异质性及其他相关研究
-
采用集合转化的方法构建HIV-1蛋白酶区和反转录酶区T-A克隆载体
DNA重组技术是将两个或多个单独的DNA片段连接起来产生一个能在特定宿主中自主复制的DNA分子。重组DNA分子简单的构建方法是将基因片段克隆到质粒或噬菌体等克隆载体上。常用的质粒载体有pBR322、pUC和pGEM等。这些载体含有不同的多克隆位点,适于将含有不同酶切位点的DNA片段连接起来[1]。
获得性免疫缺陷综合征(acquired immune defi-ciency syndrome, AIDS)又称艾滋病,是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)引起的一种严重危害人类健康的致死性传染病。在HIV感染的所有阶段,都有持续高水平的HIV复制[2]。这种病毒的持续复制与耐药的发生和发展密切相关。HIV-1为单链RNA病毒,基因组全长约9.8 kb,中央编码区由3个结构基因gag、pol、env组成,其中pol基因片断覆盖 HIV 蛋白酶和反转录酶的编码区,目的片段长度为1865 bp[3,4]。我们采用集合转化方法对HIV-1反转录酶区进行T-A克隆,以得到重组质粒,为表型耐药下游实验摸索一套较为成熟的方法,报告如下。 -
白纹伊蚊乙酰胆碱酯酶基因片段序列分析
媒介昆虫抗性已成为当前虫媒病防制中的突出问题[1-3],作者曾报道白纹伊蚊乙酰胆碱酯酶(AChE)基因片段的克隆及鉴定[4],本实验选择白纹伊蚊基因组DNA AChE基因片段克隆进行DNA测序,并分析其序列特征,为进一步研究其AChE与抗药性的关系提供依据.
-
SmaRT快速克隆多药耐药基因(MDR1)cDNA产物
肿瘤细胞在化疗中会对许多药物产生耐药性,称多药耐药(multidrug res i stance,MDR),导致MDR的一个重要机制就是细胞膜上一种分子量为170K Da的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的过度表达[1]。P- gp主要由位于人第7号染色体q21.1的多药耐药基因MDR1编码。研究MDR多在信使核糖核酸(mRNA)和蛋白质水平。MDR1cDNA长4669bp,第179~ 3840bp之间为可读区,共编码1280个氨基酸残基,其中第185密码子被认为是编码影响P-gp药物结合位点的氨基酸残基。把包含185密码子的长约269bp的M DR1cDNA片段克隆到载体PGEM-3Zf(+)中作为探针,为进行体外转录或对临床标本进行分子杂交做好前期工作[2]。
-
噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用
1985年,Smith GP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1].1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库.1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3].这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响.
-
原癌基因Bcl-2重组腺病毒的构建及表达
目的:构建Bcl -2的正义和反义重组腺病毒载体,以研究Bcl-2过度表达对周围神经损伤后,脊髓前角运动神经元抗凋亡能力和轴突再生的影响.方法:用EcoRI酶切pB4,0.8%琼脂糖凝胶电泳回收0.91kp片段,将该片段克隆到pcDNA3.1质粒的EcoRI 位点,分别用EcoRI和BamHI酶切重组pcDNA/Bcl-2质粒以鉴定插入片段的大小和方向,正向插入被BamHI切出260bp片段,命名为pcDNA/sen se-Bcl-2;反向插入被切入650bp的片段,命名为pcDNA/antise nse-Bcl-2.用Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ双酶切重组的正、反质粒,回收0.9 1kb DNA片段并克隆到腺病毒穿梭质粒pAdCMV-Linker的HindⅠⅡ和EcoR Ⅴ位点,即得到pAdCMV/sense-Bcl-2和pAdCMV/a ntisense-Bcl-2.pAdCMV/s-Bcl-2、pAdCMV/as- Bcl-2分别和pJM17质粒混合,由脂质DOTAP介导共转染80%成片的293细胞 ,共转染7天后可见圆形细胞呈葡萄串状丛集分布于正常的293细胞上,并出现病毒空斑,离心收集上清,并将细胞在-20℃及37℃反复冻融3次,离心收集上清,感染正常293 细胞,培养48小时后分别进行Bcl-2 cRNA原位杂交和Bcl-2免疫组化染色鉴定阳性腺病毒.阳性的重组腺病毒大量扩增,经CsCl超速离心纯化病毒,所得腺病毒分别为AdCMV/sense-Bcl-2和AdCMV/antisense-Bcl -2.结果:Bcl-2cRNA探针原位杂交、Bcl-2单克隆抗体免疫组化的方法从感染AdCMV/sense-Bcl-2重组腺病毒的293细胞中检测到Bcl-2的表达.结论:重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞内进行有效复制.成功构建了B cl-2重组腺病毒,为进一步研究Bcl-2重组腺病毒的功能提供了条件.
-
食管癌组织中HPV16型L2线性抗原基因的克隆及原核表达
[张菊,阎小君,严泉剑,段杰,侯瑜,苏成芝.世界华人消化杂志,2001;9(3):273-278]目的通过聚合酶链方法,以特异引物,从感染人乳头瘤病毒的新鲜食管癌组织获得人乳头瘤病毒1 6型晚期表达基因I2保守区线性抗原片段的基因,并体外表达,获得具有抗原活性的原核表达蛋白,以探索研制低廉,方便及准确的人乳头瘤病毒感染的新型诊断试剂.方法在前人研究的基础上,经计算机检索,选定与食管癌高度相关的人乳头瘤病毒16型晚期表达基因L2N端的一段基因,采用特异引物及聚合酶链方法从多例人乳头瘤病毒感染的食管癌组织DNA模板中,获得人乳头瘤病毒16型晚期表达基因L2保守区线性抗原片段的基因,经克隆入测序载体验证DNA大小及序列后,将HPV16 L2 DNA保守区线性抗原基因片段克隆入高效原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,初步以Western-blot测定表达产物的抗原性:与乳头瘤病毒抗体及感染者血清的反应活性.结果以我们设计的特异引物,从两例人乳头瘤病毒感染阳性的食管癌组织DNA模板中以得到预期大小的PCR产物,并能插入预定的克隆载体中测序,所得基因的序列符合目的基因的序列,且两例组织所得的目的DNA序列完全一致,其插入大肠杆菌表达载体能获得表达,且表达产物具有抗原活性,能与商品化的乳头瘤病毒抗体及乳头瘤病毒感染患者的血清发生抗原抗体反应.结论从食管癌组织中能检出人乳头瘤病毒HPV16型晚期表达基因区L2特定片段的基因,该片段确具高度保守性.在大肠杆菌中表达此片段所获得的表达产物,有抗原活性,有望用于流行病学检查,预警人乳头瘤病毒感染相关的癌症发生. (潘伯荣)
-
丙型肝炎病毒H株包膜糖蛋白在昆虫细胞中的表达
[付莉,徐志凯,汤丽霞,薛小平,尹文 . 细胞与分子免疫学杂志,2001;17(4):337-339] 目的利用杆状病毒表达系统,在昆虫细胞中表达了丙型肝炎病毒(HCV)H株的包膜糖蛋白E,并应用表达产物对HCV感染患者血清中抗膜蛋白抗体进行检测. 方法将HCV H株E基因片段克隆到杆状病毒转移载体上,转染昆虫细胞,表达包膜糖蛋白,经免疫杂交法鉴定表达产物,并用细胞间接免疫荧光法检测患者血清抗膜蛋白抗体的水平. 结果 Western blot显示,表达产物中有多条分子量不同、可与HCV RNA阳性血清反应的蛋白. 细胞免疫荧光染色表明,HCV包膜糖蛋白在细胞浆中表达.用表达产物分别检测HCV患者血清,发现仅11.4%血清中含有膜抗体. 结论成功利用昆虫细胞表达了HCV包膜糖蛋白,为HCV疫苗的研究奠定了基础.(何扬举)
-
噬菌体展示技术的原理及在肿瘤治疗中的应用
噬菌体展示技术初是由美国Missouri大学的Smith创建的,是一种噬菌体表面表达及筛选技术[1]。噬菌体展示技术的原理是以噬菌体为载体将外源蛋白的核酸片段克隆至噬菌体衣壳蛋白基因中,以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面,用固定化的靶分子筛选与外源蛋白亲和的噬菌体分子,不能结合的噬菌体被洗掉,而能结合的噬菌体被保留下来并通过感染大肠杆菌得以扩增、富集和筛选[2,3]。本文将概述噬菌体展示技术的基本原理与类型及其在肿瘤治疗中的应用。