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单细胞凝胶电泳技术在军事毒理学中的应用
由Ostling和Jonhanson首先提出,后又经Singh和Olive建立和改进的单细胞凝胶电泳(Single Cell Gel Electrophoresis,简称SCGE)技术,因其细胞电泳形状颇似慧星,又称慧星试验(Comet Assay).它是一种测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术,与传统方法相比,其简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记,具有极高的实用价值.
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2000年-2004年杭州地区副溶血弧菌分离株的PFGE和RAPD分型
应用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)及随机放大多态性DNA分析(random amplified polymorphicDNA analysis,RAPD)方法对2000年-2004年在杭州地区分离的03:K6型和O4:K8型致病性副溶血弧菌菌株进行分子分型,探讨近年杭州地区分离的O3:K6型和O4:K8型副溶血弧菌菌株与国际"大流行"O3:K6型菌株间的关系.
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用PFGE鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌
快速、准确地鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌(MOTT)对结核病与非结核分枝杆菌病的诊断与治疗具有重要的指导意义.本研究以传统鉴定法为"金标准",对94株分枝杆菌进行了分析,基于脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)及聚类分析的原理,建立了鉴定结核分枝杆菌与MOTT的新方法,并对其进行了方法学评价.
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实时荧光定量法和PCR-DGGE技术研究大肠癌患者肠道微生态特征
大肠癌是常见的恶性肿瘤之一,随着我国经济发展以及人群膳食结构、生活方式的转变,其发病率逐年升高。长期以来,大肠癌的早期诊断基本靠传统的肠镜检查,对被检查者有一定的诊疗风险和痛苦,不易于推广。研究发现,哺乳动物肠道中有多达1000余种、1014个以上的细菌与之共存。肠道菌群的生态状况、其代谢产物及产生的抗原可通过与机体代谢和免疫的相互作用对宿主产生巨大的影响,与肠癌的发生密切相关[1]。了解大肠癌患者和健康人群之间肠道菌群的异同,探索肠道菌群检测在大肠癌早期筛查中的可行性具有潜在意义[2]。本研究采用实时荧光检测( real-time q-PCR)及变性梯度凝胶电泳( denatured gradient gel electrophoresis , DGGE)技术分别从定量、定性角度对大肠癌和正常个体粪便样品进行检测,以期发现大肠癌患者与健康人群肠道菌群的异同,找到肠道微生物的指示菌群,为疾病的预防和早期监测提供一定的理论依据。
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单细胞凝胶电泳技术在运动医学中的应用
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)又称彗星实验(comet assay),是近年来发展起来的一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的新技术.SCGE实验初由Rydbery和Johanson(1978)提出,以后经Ostling和Johansont[1](1984)及Singh[2](1988)等对实验条件进行改良,使其具有简便快速、灵敏性高、重复性好、无需放射性标记等优点,目前已被广泛应用于临床药物筛选、肿瘤诊断与治疗、衰老和细胞凋亡机制的探讨以及遗传毒理学和生物监测等研究领域[3-5].
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PCR-变性梯度凝胶电泳检测和鉴定解脲脲原体和人型支原体
为方便支原体病研究我们建立了解脲脲原体(Uu)和人型支原体(Mh)通用的PCR-变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)检测技术.
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载脂蛋白A和B的结构功能与测定方法及其标准化
自1968年shore和Shore[1]用聚丙烯酰胺琼脂凝胶电泳法(polyacrylamide gel electrophoresis)从人高密度脂蛋白(HDL)中分离纯化得到载脂蛋白(apoliprotein/apoprotein,Apo)以来,随着对Apo的生理、生化、病理及分子生物学研究的迅速发展与深入,Apo的基础与临床研究在脂类学(lipidology)中占有很重要的地位.
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构象敏感凝胶电泳快速检测HBV准种序列异质性的方法
目的:建立一种快速检测乙型肝炎病毒(HBV)准种遗传异质性的方法并验证其敏感性和特异性.以满足研究HBV准种需要检测大量病毒序列的要求.方法:在构象敏感凝胶电泳(CSGE)检测方法的基础上,针对HBV核酸序列组成的特殊性,调整凝胶中使用的甲酰胺和乙二醇浓度并加入一定量的尿素,另外通过一次预电泳优选驱动序列.后用改进地CSGE检测已知序列的HBV C-ORF区片段克隆,并把检测结果与DNA序列分析结果进行比对,验证该方法的敏感性和特异性.结果:用改进地CSGE检测克隆的HVC C-ORF区片段获得了清楚地电泳图谱.对已知序列的HBC C-ORF区克隆片段进行检测:在34个克隆中发现了27种不同的克隆型,准种内病毒株(克隆)频率介于2.9~17.6%,克隆型之间的遗传距离介于0.2~2%.CSGE所得结果与DNA序列分析结果高度一致.结论:我们建立的CSGE具有高度的敏感性和特异性,完全可以用于检测HBV准种序列的异质性及其他相关研究
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制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与纯化豚鼠内耳抗原
粗制内耳抗原(crude inner ear antigen,CIEAg)广泛用于自身免疫性内耳病(autoimmune inner ear disease,AIED)的研究,包括建立动物模型和作为抗原检测AIED患者血清自身抗体[1,2]。但CIEAg成分复杂,其中何种亚组份起关键作用尚不清楚。我们通过制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳(preparative polyacry-lamide gel electrophoresis,简称制备性PAGE)分离纯化豚鼠CIEAg的主要亚组份,为深入研究AIED的发病机制和寻找内耳特异性抗原奠定基础。 一、材料和方法 1.豚鼠CIEAg的制备:取200~300 g耳廓反射正常的豚鼠(华中科技大学同济医学院实验动物部提供),参照肖红俊等[3]报道的方法提取。考马斯亮蓝G-250法测定其浓度。 2. 凝胶电泳方法:①分析性聚丙烯酰胺凝胶电泳(analytical polyacrylamide gel electrophoresis,以下简称分析性PAGE)凝胶厚1.25 mm,浓缩胶和分离胶的浓度分别为4%和10%;加样量为4~32 μg,蛋白质分子量标准加样20或40 μg;样品进入分离胶前恒电流10 mA,进入分离胶后恒电流20 mA,15℃恒温电泳;常规考马斯亮蓝R-250染色和脱色,并对脱色后凝胶进行薄层扫描;②制备性PAGE 凝胶厚3 mm,加样量为2~3 mg;样品进入分离胶前恒电流40 mA,进入分离胶后恒电流50 mA,15℃恒温电泳;电泳结束后,快速考马斯亮蓝R-250染色液加温染色40~50 min,然后在含有5%甲醇、10%冰乙酸的脱色液中加温脱色10 min左右[4],其余同①;③制备性PAGE和分离亚组份的回收电泳同②;电泳结束后自板胶的中央纵向切下宽1 cm左右的窄带,进行快速染色和脱色。将染色后的凝胶条用蒸馏水冲洗后复位,根据染色凝胶蛋白区带的位置,从未染色的凝胶上切下主要蛋白区带冰浴匀浆。-50℃保存备用。
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运动性氧应激与DNA损伤
1 DNA损伤的检测方法目前DNA氧化损伤的检测方法有多种,如微核实验(cytokinesis-block micronucleus,CBMN)[15]、高压液相层析法(high-pressure liquid chromatography,HPLC)[16]、电子自旋共振技术(electron spin resonance,ESR)和单细胞凝胶电泳技术(single cell gel electrophoresis assay,SCGE).
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单细胞凝胶电泳技术及其在辐射生物学中的应用
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE),又称彗星分析(Comet assay),是利用断裂的DNA碎片在裂解液的作用下,从DNA的超螺旋结构中释放出来,在电泳时移向阳极的彗星样影像而对损伤的DNA进行检测的一种方法,是检测各种哺乳动物细胞DNA断裂的新技术[1].这种技术可以测定单个细胞DNA链的断裂,与传统方法相比,由于其简便、快速、敏感、所需样品量少,无需细胞处于生长状态和使用放射性同位素,故有很强的实用价值.SCGE已广泛用于环境生物监测、辐射生物学、遗传毒理学、药物筛选、毒物致癌机理、肿瘤发病机理、诊疗、衰老和细胞凋亡机理的研究.现就SCGE技术的原理和方法及其在辐射生物学领域的应用作一简要介绍.
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Objective. To study the associations of IDDM3, IDDM4, IDDM5 and IDDM8 with insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). Methods. The polymorphisms of short tandem repeat (STR) loci D15S657, D11S1369, D6S2420 and D6S503, linked to IDDM3, IDDM4, IDDM5 and IDDM8 respectively, were studied by polymerase chain reaction and polyacrylamide gel electrophoresis (PCR-PAGE) followed by direct sequencing of PCR products in 105 normal Chinese Han nationality subjects and 48 patients with IDDM. Results. The allele frequencies of allele A5 at D15S657 locus, allele A5 at D11S1369 locus and allele A4 at D6S2420 locus were increased significantly in patients with IDDM compared to those in the control group. No difference in the allele frequencies at D6S503 locus was observed between IDDM and control group. Conclusion. IDDM3, IDDM4 , IDDM5 but not IDDM8 may be associated with IDDM in Chinese Han nationality population.
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心脏术后患者鲍曼不动杆菌感染基因同源性分析
鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii,aba)是引起医院内感染的重要致病菌,对常用的大多数抗生素耐药.2001年10月至2002年8月,上海市中山医院心脏外科重症监护室(cardiosurgical intensive care unit,CICU)aba感染率异常增高,陆续从患者血或痰标本中分离出aba.为了解CICU内是否发生了aba的交叉传播,我们收集自不同患者分离的aba 28株,作脉冲场凝胶电泳(pursed-field gel electrophoresis,PFGE)全DNA指纹图谱分析,通过对菌株进行基因分型和亲缘关系鉴定,明确这些菌株在流行病学上的相关性.
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蛋白质组学与卵巢癌研究
随着后基因组时代的到来,蛋白质组学已成为一个发展迅速、日益重要的研究领域,高分辨率的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-D PAGE)与质谱分析技术(mass spectrometry,MS)和生物信息学的结合使蛋白质组分析及其在临床疾病中的应用成为可能.
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单细胞凝胶电泳技术在职业和环境医学生物监测中的应用
单细胞凝胶电泳技术Single Cell Gel Electrophoresis,SCGE)是由Osting和Johanson首先提出,后经Singh等进一步完善的,在单个细胞水平上检测DNA损伤和修复的方法。其基本原理是:包埋在琼脂凝胶中的细胞在中性或碱性条件下经裂解与解螺旋后,如果细胞未受损伤,电泳时DNA因其分子质量大停留在核基质中,经荧光染色后呈圆形的荧光团,无拖尾现象。若有DNA损伤,在碱性电泳液中,先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链,单链断裂的碎片因分子质量小可进入凝胶中,带负电荷的DNA游离断片在电泳时向阳极伸展,在荧光显微镜下,细胞核形成一个亮的头部和尾部,形似夜空中的彗星,故又称彗星试验(Comet Assay)。细胞核DNA受损愈严重,产生的断链或易变性断片就愈多,其断链或断片也就愈小。在电场作用下迁移的DNA量多,迁移的距离长,表现为尾长增加和尾部荧光强度增强,通过测定迁移部分的光密度和迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。与测定DNA损伤的传统方法相比较,SCGE具有以下优点:(1)SCGE能够对单个细胞的DNA损伤进行研究,避免了只能对细胞群体的DNA改变进行检测的不足;(2)使用范围广泛,可检测各种类型的组织、细胞,如脱落的人颊粘膜细胞、人白血病K562细胞、鱼的红细胞、植物种子细胞等,其中常用的是人外周血淋巴细胞;(3)简便,快速(一个工作日可完成),样品量少(一般只需几千个细胞),无需放射性标记;(4)敏感性高,可检测出0.1个DNA断裂/10-9道尔顿,在检测DNA断裂损伤方面,具有高度灵敏性,比目前已知的各种细胞水平的致突变方法如Ames、微核试验等更加敏感[1]。近十年来,该技术已广泛应用于遗传毒理学、放射生物学、药物筛选、肿瘤细胞生物学、衰老和细胞凋亡机制、人群流行病学调查等领域,研究各种有核细胞经受试验诱导的DNA损伤和修复[2]。该方法在职业医学中已得到广泛应用,在环境遗传毒物监测中的应用也有报道,本文就SCGE在职业医学及环境生物监测中的应用现状作一综述。
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单细胞凝胶电泳在放射医学中的应用进展
单细胞凝胶电泳技术(Single Cell Gel Electrophoresis Assay,SCGE),又称彗星试验(Comet Assay)或微凝胶电泳(Microgel Electrophoresis,MGE),它是在核酸沉淀法(Nucleoid Sedimentation)和晕圈分析(Holo Assay)及弱碱性条件下的单细胞凝胶电泳等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测哺乳类有核细胞DNA断裂的新技术.它主要包括Olive等(1984)建立的测定DNA双链断裂(dsb)的中性微凝胶电泳技术和Singh等(1988)建立的测定DNA单链断裂(ssb)的碱性微胶电泳技术.
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卵巢癌顺铂敏感株C0C1与其耐药亚株C0C1/DDP间的差异蛋白组学分析
随着后基因组时代的到来及蛋白质组学理论及技术的迅速发展及完善,从蛋白质这一全新的角度探讨卵巢癌的顺铂耐药机制已成为可能.本研究采用差异凝胶电泳(difference gel electrophoresis, DIGE)技术比较分析了卵巢癌顺铂敏感株(C0C1)及耐药株(C0C1/DDP)的差异蛋白,期待找到与顺铂耐药相关的关键分子.
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美国新港沙门菌感染的暴发与黄瓜的关联性
2014年8月,美国国家食源性疾病监测分子分型网络(PulseNet)检测到一个跨州的新港沙门菌血清型感染的群组,其具有无法区分的脉冲场凝胶电泳(Pulse-Field Gel Electrophoresis,PFGE)带型(限制性内切酶XbaⅠ,带型为JJPX01.0061.信息来源http://www.cdc.gov/pulsenet).
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脑膜炎奈瑟菌分子分型方法的进展
目前,脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis,Nm)分型方法可分为免疫学为基础的传统分型方法和分子生物学分型方法,前者包括血清分群和单克隆分型,后者包括脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)、多位点测序分型(multi locus sequence typing,MLST),核糖体分型(ribotyping),随机扩增多态性DNA分型(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)等.
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二维凝胶电泳的新技术及其应用
1975年,O'Farrell以及Klose等人发明了双向凝胶电泳(two- dimensional gel electrophoresis, 2-DE),根据样品中蛋白质的两个重要理化特性:等电点(is-oelectric points, PI)和分子量( molecular weight, MW),将样品中的蛋白质进行分离.其原理是第一向基于蛋白质 PI不同用等电聚焦( isoelectric focusing, IEF)分离,第二向则按 MW的不同用聚丙烯酰胺十二烷基硫酸钠凝胶电泳( sodium dodecyl sulfate_polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE)分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开.其后的 25年中, 2- DE经过了多方面的改进,而且相应蛋白鉴定技术也得到了发展,这使得 2- DE广泛应用于蛋白质组学( proteomics)领域,成为研究"结构蛋白质组"与"功能蛋白质组"的有使用价值的方法,在蛋白质组研究中有着不可或缺的地位.现对 2- DE近期的进展及其应用作一综述.