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乙型肝炎病毒准种异质性对干扰素应答性的影响
目的:了解乙型肝炎病毒(HBV)准种遗传异质性对干扰素(IFN-α)应答性的影响.方法:用构象敏感凝胶电泳(CSGE)对20例(完全应答者和无应答者各10例)已接受IFN-d治疗的慢性乙型肝炎患者治疗前血清中HBV准种的异质性进行检测,分析准种的异质性与IFN-α应答性的关系.结果:HBV DNA含量在IFN-d应答患者和非IFN-d应答患者之间无差异(7.27 ×1010±8.79×1010vs5.16×1010±5.13×10 10,P>0.05),但是,在无应答患者HBV准种的复杂性和遗传差异性明显高于应答患者(830±1.89 vs185±2.68,P<0.001和0.926±0.008vs0.869±0.016,P<0.001).结论:HBV准种的异质性对IFN-α的应答性有影响.
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构象敏感凝胶电泳快速检测HBV准种序列异质性的方法
目的:建立一种快速检测乙型肝炎病毒(HBV)准种遗传异质性的方法并验证其敏感性和特异性.以满足研究HBV准种需要检测大量病毒序列的要求.方法:在构象敏感凝胶电泳(CSGE)检测方法的基础上,针对HBV核酸序列组成的特殊性,调整凝胶中使用的甲酰胺和乙二醇浓度并加入一定量的尿素,另外通过一次预电泳优选驱动序列.后用改进地CSGE检测已知序列的HBV C-ORF区片段克隆,并把检测结果与DNA序列分析结果进行比对,验证该方法的敏感性和特异性.结果:用改进地CSGE检测克隆的HVC C-ORF区片段获得了清楚地电泳图谱.对已知序列的HBC C-ORF区克隆片段进行检测:在34个克隆中发现了27种不同的克隆型,准种内病毒株(克隆)频率介于2.9~17.6%,克隆型之间的遗传距离介于0.2~2%.CSGE所得结果与DNA序列分析结果高度一致.结论:我们建立的CSGE具有高度的敏感性和特异性,完全可以用于检测HBV准种序列的异质性及其他相关研究
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高分辨率熔解曲线分析:一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术
目前,DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorplaism,SNP)的检测方法有2种:一是针对特定的位点合成序列特异性探针,如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等,用于检测已知突变;二是以核酸的物理性质为基础的检测方法,如变性一高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等,此类方法可用作突变筛查,但无法明确突变性质.
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严重急性呼吸综合征患者肺组织中S基因病毒准种特性的初步研究
严重急性呼吸综合征(SARS)病原体是一种与冠状病毒(coronaviruses)类似的新的正链RNA病毒,基因组全长约为30kb,包括复制酶A、复制酶B、S、E、M基因编码区和14个目前尚未清楚功能的开放阅读框.SARS病毒的变异率估计为每天(8.26×10-6±2.16×10-6)/nt,与普通RNA病毒类似[1].SARS病毒感染呈很短暂的急性自限性过程,变异株在患者体内能否积累形成准种,所形成准种的异质性如何?有关研究目前报道还不多,为此我们采用构象敏感凝胶电泳(CSGE)及核酸序列分析的方法初步检测了1例患者肺组织中SARS病毒准种的复杂性及差异性,结果报道如下.
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视网膜色素变性光感受器发育相关基因分型的研究
目的探讨一新近发现的与氧调节光感受器发育相关基因(ORP1)在常染色体显性遗传(RP)发病机制中的作用.方法运用聚合酶链反应(PCR)、构象敏感凝胶电泳(CSGE)和DNA直接测序方法对92例RP患者ORP1基因全编码区进行突变的筛选与检测.结果检出一ORP1致病突变因子R677X,并首次发现一非致病的无义突变因子R1933X.结论预测香港地区大约有1.1%(95%的可信区间为5.4%以下)的RP是由ORP1基因突变所致.R1 933X无致病意义,结合近发现的Y1053(1-bp del)的病理意义,推测密码子1 052至1 933区域的稳定对ORP1结构及功能的维持起着重要的作用.
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构象敏感凝胶电泳用于检测乙型肝炎病毒P区核苷类似物耐药准种的初步研究
目的 建立经济、实用、准确的乙型肝炎病毒准种分析方法.方法 采用"PCR-克隆-测序"的方法,对2例血清样本的各60个克隆测序,χ2检验分析所研究克隆毒株的数量对准种组成反映准确性的影响;用建立的构象敏感凝胶电泳(CSGE)法区分克隆目的片段,比对CSGE结果与测序结果的一致性.结果 对于优势准种比例的反映检测15个克隆以上(χ2=2.700,P=0.100》0.05)、对劣势株的检出检测30个以上则与检测60个克隆无统计学差异(χ2=2.411,P》0.05);比较8个样本共270个克隆的CSGE及测序结果,两者表现出良好的对应性(准确率达98.9%).结论 用"PCR-克隆-CSGE-测序"的方法视不同需求检测15或30个克隆可准确反映1份血清样本中HBV准种的组成和分布.
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PCR-构象敏感凝胶电泳技术在血友病A基因分型诊断及携带者检测中的应用
所有的HA家系(含散发)进行直接基因诊断,理论上可筛查新突变并明确其突变类型.该法简便、快速、成本低,在HA直接基因诊断及携带者筛查中优势独特,应具重要应用价值.
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视网膜色素变性患者中视网膜色素变性1基因点突变的研究
目的研究中国视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)患者RP1基因的突变频率、特征及其在RP发病机理中所起的作用.方法运用构象敏感凝胶电泳(conformation sensitive gel electrophoresis,CSGE)和DNA直接测序方法对101例香港地区RP患者的RP1基因全编码区进行突变的筛选与检测.结果 101例RP患者中检出1例患者携带常见的RP1致病突变-R677X,另外在3名正常个体及1例Stargardt患者中检出非致病的无义突变-R1933X.RP1基因在所有RP患者中的突变检出率为1/101.突变终导致RP1蛋白严重截短.此外,在本研究人群中还发现10个错义突变,除M479I的病理意义未确定之外,其余均系RP1基因的多态现象.结论 R1933X无致病意义,提示羧基端224个氨基酸的区域可能为RP1蛋白非功能区,结合近发现的RP1羧基端的移码突变-Y1053(1bp del)的病理意义,推测RP1蛋白中相应片段(密码子1052~1933)的缺失会导致RP的发生.为证实这种推测,大范围的RP1基因分型工作是有必要的,并且可同时发现更多的RP致病突变以及不同于其他种族人群的RP1基因多态变化.