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应用DNA微阵列技术快速鉴定分枝杆菌菌种
目的 利用DNA微阵列的高通量、高效性,建立一种快速、简便的分枝杆菌分子菌种鉴定方法,为临床医师正确诊断提供依据.方法 以DNA直接测序法为对照,通过PCR-SSCP和DNA微阵列技术分析28种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和465株分枝杆菌临床分离株的菌种.结果 应用DNA微阵列技术分析28种分枝杆菌标准菌株和9种非分枝杆菌菌株,特异性100%.465株分枝杆菌临床分离株中,经16S rRNA PCR-SSCP初步菌种鉴定,256株为结核分枝杆菌复合群,应用DNA微阵列分析,显示与分枝杆菌属探针M和结核分枝杆菌复合群探针a杂交阳性,两种鉴定方法结果一致;209株PCR-SSCP初步鉴定为非结核分枝杆菌的分离株,经芯片分析,68株为龟分枝杆菌龟亚种和脓肿亚种,46株为胞内分枝杆菌,34株为堪萨斯、瘰疬、胃和猿猴分枝杆菌复合群,31株为偶然分枝杆菌,16株为戈登分枝杆菌,3株为鸟分枝杆菌,2株为海和溃疡分枝杆菌复合群,1株为土分枝杆菌,1株为迪氏分枝杆菌,1株为草分枝杆菌;另6株只与探针M杂交,经测序显示5株为胞内分枝杆菌,但其基因序列与标准菌株不完全相同,1株为新金色分枝杆菌,芯片上无鉴定该菌种的探针.结论 用DNA微阵列可简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种,提高分枝杆菌病的正确诊断率,指导临床合理治疗.
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PCR-SSCP 技术快速检测结核分枝杆菌三种基因突变
聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)是快速检测基因突变的重要方式之一[1].应用此法对辽宁省90例涂阳患者痰标本分离结核分枝杆菌进行rpoB、rpsL、56例katG基因突变检测,与传统耐药结果比较分析,寻找结核分枝杆菌耐药性与基因突变的关系.
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80株淋球菌分离株青霉素耐药性与penA及PonA基因的关系
目的 探讨淋球菌青霉素耐药性与青霉素结合蛋白1基因和2基因(ponA、penA)突变的关系.方法 采用琼脂稀释法对淋球菌临床分离株进行青霉素敏感性测定,分别运用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)对淋球菌penA及ponA基因进行分析.结果 在检测出的80株淋球菌临床分离株中,所有菌株的penA基因均发生了(Asp345A)的插入突变,而菌株表现出对青霉素不同程度的耐药性;通过RFLP分析检测出有近93.7%的菌株发生了ponA基因第421位氨基酸由亮氨酸变成脯氨酸(Leu421→Pro)的突变.同时研究还表明所有的PPNG菌株也可同时发生penA基因的突变,除2例ponA基因未突变外,94.4%6(34/36)的PPNG可发生ponA基因的突变.结论 在淋球菌流行株中染色体介导和质粒介导两种方式协同作用造成了淋球菌对抗生素的高度耐药性.
关键词: 淋球菌 青霉素 单链构象多态性 限制性片段长度多态性 -
中国大麦黄花叶病毒分离物的分子变异
13个供试的中国和英国大麦黄花叶病毒(BaYMV)分离物,经RNA1和RNA2全基因组不同区域DNA片段单链构象多态性分析(SSCP),外壳蛋白基因和RNA2 70kD基因5'端705碱基序列分析,以及此705碱基DNA片段限制性内切酶图谱分析结果,它们的RNA1和RNA2彼此无一相同,其中RNA2变异比RNA1更大.由于变异十分复杂,且没有规律性,因而当前通用的分子生物学技术尚不能简单地用于BaYMV致病性分化或株系区分和检测.
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汉族人群血管紧张素原基因的新单核苷酸多态性位点
应用改进的PCR-SSCP技术、多种聚丙烯酰胺凝胶电泳和PCR产物直接测序等方法,分析人的血管紧张素原(AGT) 基因启动子区5'远侧端的单核苷酸多态性(SNP).在非变性胶上,发现不同样品的PCR产物(双链DNA分子)电泳迁移率不同;而在变性胶上,对应的单链DNA分子电泳迁移率相同;PCR产物直接测序的结果表明,在同一PCR扩增片段中同时存在两个SNPs位点(G-1074T, A-1179G);通过476个不同样品的实验结果,进一步证实两个SNPs位点处于完全的连锁不平衡关系.GenBank同源性比较结果显示: A-1179G为中国汉族人群所特有.
关键词: 单链构象多态性 单核苷酸多态性 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 -
复发性外阴阴道念珠菌病患者及性伴侣带菌情况分析
目的 研究复发性外阴阴道念珠菌病(RWC)复发相关因素.方法 选择55例RVVC患者及其中45位患者性伴侣,取阴道、肛门、口腔及龟头分泌物分离念珠菌,采用ITS1区单链构型多态性(SSCP)分析和大亚基26S rDNA基因D1/D2区序列分析相结合的方法进行菌种鉴定,应用微卫星CAI位点的SSCP和基因扫描分析相结合的方法进行白色念珠菌的基因型测定.结果 RVVC患者阴道、肛门、口腔及其性伴侣龟头分泌物的念珠菌培养阳性率分别为100.0%(55/55)、61.8%(34/55)、1.8%(1/55)和60.0%(27/45),各部位念珠菌感染均以白色念珠菌为主,且所占比例无明显差异.同一患者阴道与肛门、阴道与性伴侣龟头分泌物的白色念珠菌基因型符合率分别为86.2%和54.5%.结论 肠道及性伴侣龟头携带的念珠菌可能是RVVC复发的重要因素之一.
关键词: 复发性外阴阴道念珠菌病 基因型 单链构象多态性 基因扫描 -
微卫星DNA标记技术及其在蚊虫生物学研究中的应用
遗传标记是指用来区分不同的个体或群体,能够稳定遗传的物质或性状,是研究生物遗传学、发育生物学及分类学的重要工具.遗传标记经历了不同的发展阶段,20世纪70年代以来,随着限制性内切酶的发现和DNA重组技术的创立,遗传标记的研究重点转向遗传信息的载体--DNA分子,出现了多种分子遗传标记.常用的DNA分子标记技术有:DNA限制性酶切长度多态性(RFLP);数量可变的串联重复序列(VNTR)(主要包括微卫星和小卫星)分析;DNA序列分析以及基于PCR的随机扩增DNA多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)和单链构象多态性(SSCP)等分析技术.DNA分子遗传标记,特别是微卫星DNA与其他遗传标记相比,具有稳定性高、信息含量高、种群中分布广泛等优点,正日益受到人们的重视.
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我国部分地区蜱中莱姆病螺旋体的检测与基因分型研究
目的对我国部分地区的多种蜱类进行莱姆病螺旋体的检测和基因分型. 方法选择我国黑龙江、吉林和浙江省部分林区为调查点,采集当地蜱类,用巢式PCR法进行检测,阳性产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析和单链构象多态性(SSCP)分析,确定莱姆病螺旋体的基因型. 结果共检测蜱512只,阳性126只,阳性率24.61%.其中吉林全沟硬蜱带菌率为37.00%,黑龙江全沟硬蜱带菌率为20.87%,浙江长角血蜱带菌率为28.07%.RFLP分析表明,蜱中莱姆病螺旋体包括B. garinii和B. afzelii两种基因型.SSCP分析显示为7种亚型,其中B. garinii分为5个亚型,B. afzelii分为2个亚型.发现有3只蜱同时感染不同基因(亚)型莱姆病螺旋体. 结论证实B. garinii和B. afzelii基因型为我国莱姆病螺旋体的优势基因型,并在我国蜱中发现莱姆病螺旋体不同基因(亚)型的混合感染.
关键词: 莱姆病螺旋体 基因型 限制性片段长度多态性 单链构象多态性 蜱 -
通用引物单链构象多态性技术检测呼吸道常见病原菌的研究
目的 探讨通用引物单链构象多态性技术用于呼吸道常见病原菌检测的可行性. 方法 选取7种常见呼吸道感染细菌,采用通用引物对细菌的16SrRNA基因进行扩增,对扩增产物进行单链构象多态性分析. 结果 经过扩增,7种常见病原菌均在300 bp处有清晰条带,扩增产物的单链构象多态性图谱条带数为2~4条,相对迁移率及条带间距也存在明显不同,各细菌间可相互区分. 结论 通用引物SSCP技术能快速简便地鉴定呼吸道常见病原菌.
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纤维介素基因启动子的基因多态性与重型乙型肝炎关系的研究
近年小鼠暴发性肝炎和人重型肝炎的研究表明,纤维介素(fgl2)的高表达是重型乙型肝炎肝细胞坏死的重要分子机制.我们运用单链构象多态性(single strain construction polymorphism,SSCP)分析方法对重症乙型肝炎患者、乙型肝炎病毒携带者以及健康人hfgl2基因启动子的基因多态性进行了研究.
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PCR-SSCP分析急性淋巴细胞白血病TCR基因寡/亚克隆重排及临床意义
目的为研究急性淋巴细胞白血病(ALL)TCR基因寡/亚克隆重排及与临床关系. 方法采用PCR-SSCP技术分析81例ALL TCR VγⅠ-Jγ基因重排. 结果 65例(80.2%)ALL病人存在TCR VγⅠ-Jγ基因重排,8例(8.6%)病人存在寡/亚克隆重排;寡/亚克隆ALL的白细胞计数显著高于非寡/亚克隆ALL(P<0.01);寡/亚克隆ALL的完全缓解率为37.5%,显著低于非寡/亚克隆ALL(80.7%)(P<0.005). 结论应用PCR-SSCP方法可确定ALL的寡/亚克隆性,ALL病人寡/亚克隆检测有助于预测疗效和预后判断.
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采用通用引物PCR配合SSCP及RFLP技术快速检测常见病原菌
目的建立一种快速检测病原菌的方法以利于临床诊断. 方法选取10种具有代表性的病原菌,采用通用引物PCR(UPPCR)对其16S rRNA基因进行扩增,并对PCR产物进行限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)和单链构象多态性分析(SSCP). 结果 RFLP电泳图谱呈现多态性,但半数菌的图谱两两相同或相似;SSCP电泳图谱各异,可以相互区分. 结论 UPPCR-SSCP技术能快速简便地检测病原菌.
关键词: 病原菌 聚合酶链反应 限制性酶切片段长度多态性 单链构象多态性 -
优化聚合酶链反应产物银染测序法鉴定白细胞抗原-DQA1*0102等位基因纯合子
聚合酶链式反应-序列特异引物(PCR-SSP)技术在人类白细胞抗原(HLA)基因分型中被广泛使用.然而,分型过程中常出现"空白基因"而影响整个结果的可靠性.对此,目前多采用DNA测序以确定各等位基因纯合子或存在新突变或结合PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法进行确认[1].我们用PCR-SSP对109名广西巴马县壮族长寿老人和71名对照组进行HLA-DQA1座位基因分型,发现了33个HLA-DQA1*0102/- 个体,经本室优化DNA直接银染测序法[2]测定,确定均为HLA-DQA1*0102/*0102等位基因纯合子,现报告如下.
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基于PCR、LDR和ELISA法检测冠心病患者APOE112位点基因型
SNP是继限制性片段长度多态性(RFLP)、短串联重复序列(STR)后的第三代分子遗传标记,目前检测SNP的方法有基因测序[1]、单链构象多态性(SSCP)[2]、RFLP[3]、高效液相[4]、基因芯片[5]、LDR[6-14]等,但都需要比较复杂的仪器进行检测.
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多基因单链构象多态性技术在大肠癌多基因突变联合测定中的应用
多基因单链构象多态性(MSSCP)是一种与多基因聚合酶链反应(PCR)联合应用,一次性快速测定多基因突变的方法[1].本研究建立了测定APC基因突变聚集区域(MCR)和K-ras第12/13密码子突变的MSSCP技术.
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聚合酶链反应-单链构象多态性结合银染技术检测低密度脂蛋白受体基因点突变
家族性高胆固醇血症(Familial hypercholesterolemia,FH)是一种常染色体显性遗传病,是导致动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)和早发冠心病的重要危险因素,其发病机理主要为低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein receptor,LDL-R)基因突变引起LDL-R功能异常.本研究应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)结合银染技术对一例临床诊断为FH的先证者的LDL-R基因进行研究,以探讨其分子病理机制.
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凝胶中的甘油对聚合酶链反应-单链构象多态性技术的影响
单链构象多态性(SSCP)是一种快速、简便、敏感性高的检测基因突变与DNA多态性的技术.为探讨凝胶中的甘油是否对这一技术产生影响,我们应用该技术结合银染法检测肺癌中P53基因第5~8外显子可能存在的点突变,考察了凝胶中甘油的作用.
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人白细胞抗原-DRB基因多态性与特应性皮炎易感性的相关性研究
目的寻找特应性皮炎(AD)患者易感的人白细胞抗原(HLA)基因型,分析该易感基因的单链构象多态性与正常人的差别.方法用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)检测122例AD患者和80名健康献血员的HLA-DRB等位基因型,并分析该易感基因的单链构象多态性.结果外源性AD组和AD合并哮喘及变应性鼻炎组HLA-DR3与正常对照组比较,基因频率升高(RR=5.27和3.59,均P<0.05),而HLA-DR6基因频率降低(RR=0.10和0,均P<0.05),而HLA-DR3阳性的16例AD患者中,仅1例的单链构象多态性与正常人不同.结论HLA-DR6是AD的抗性基因,携带有HLA-DR6的个体较不易患AD,而HLA-DR3是易感基因,携带有HLA-DR3的个体,较易患AD,而携带HLA-DR3基因的个体与正常人比较无碱基差别.
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胃肠道间质瘤组织中PDGFRα和C-kit基因突变和蛋白表达的关系
目的:检测胃肠道间质瘤(GIST)中PDGFRα和C-kit基因突变及其蛋白表达的关系及在肿瘤形成中的作用.方法:采用单链象多态性聚合酶链式反应(PCR-SSCP),免疫组化和蛋白印迹(Western blot)方法,检测GIST 52例中PDGFRα和C-kit 基因突变及蛋白表达情况.结果:GIST 52例中PDGFRα基因突变5例(9.6%),多见于梭形细胞型的胃源性GIST,C-kit基因突变28例(53.8%),多发生于小肠,并且这两种基因突变互相独立;PDGFRα蛋白表达率100%,C-kit蛋白的表达率为94.2%,突变的5例GIST PDGFRα强于C-kit突变的GIST,正常胃肠道组织和神经鞘瘤;突变与C-kit蛋白表达之间没有显著相关性(P=0.5332),而突变与PDGFRα蛋白表达之间呈显著相关性(P<0.0001).结论:GIST中PDGFRα和C-kit突变在部分GIST肿瘤发生过程中发挥了重要作用;突变位点与起源部位和组织学类型有关;大多GIST中蛋白表达与其基因突变关系密切.
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慢型丙型肝炎患者干扰素治疗前后HCV HVR1准种的动态变化
目的:探讨感染HCV1b型慢型丙型肝炎患者HCV HVR1区准种的复杂性与干扰素疗效的关系,以便对干扰素治疗疗效进行预测.方法:应用IFN治疗的慢性丙型肝炎患者共20例,于治疗前、治疗后3 mo、6 mo留取血清,-70℃冻存待测.治疗方案为:干扰能3 mu,3次/wk,肌肉注射,共24 wk.HCV HVR1准种的检测采用单链构象多态性聚合酶链反应法(SSCP法).结果:IFN治疗前,35%(7/20)的患者表现为SSCP低复杂性(SSCP条带数≤3),65%(13/20)表现为高复杂性(SSCP条带数>3).治疗3 mo后,4例患者HCV RNA阴转,均发生在低复杂性组,其余大部分患者SSCP条带数减少1-2条带.治疗6mo时,7例患者HCVRNA阴转,仅2例发生在高复杂性组.治疗结束时13例(65%)无应答患者中,8例患者SSCP条带数均较治疗前减少,2例无变化,1例恢复到治疗前水平,2例较治疗前升高.结论:HCV HVR1区准种的复杂性可以对IFN治疗进行疗效预测,治疗前准种数少者可预测对IFN治疗有较好的应答.