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莱姆病螺旋体的转移感染和致病机制
本文主要就莱姆病螺旋体从蜱到宿主动物的转移感染以及在宿主体内存活并致病的机制进行了的阐述,包括螺旋体在蜱内定居以及感染宿主动物过程中蛋白的变化及作用;螺旋体在宿主体内致病的各种机制(病原体本身的作用、免疫逃避、细胞因子的作用、自身免疫).
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中国莱姆病螺旋体宿主动物的初步调查研究
为对中国莱姆病螺旋体的宿主动物有所了解,于1987～1997年间,作者在中国16个省(市、区)的山林地区,采用血清流行病学和病原学研究方法,对牛、羊、狗、野兔和野鼠进行了莱姆病的调查研究.结果显示在我国至少有牛、羊、狗、野鼠、野兔等5种动物中有莱姆病的感染存在.牛、羊和狗的感染率分别为18.18%～32.61%、17.12%～61.21%和38.50%～60.00%.狗作为我国北方林区莱姆病螺旋体的主要生物媒介全沟硬蜱成虫的主要供血者之一,可能是较重要的宿主动物.从黑线姬鼠、棕背()、花鼠、白腹鼠、社鼠、褐家鼠、针毛鼠、白腹巨鼠和华南兔等动物分离出20株莱姆病螺旋体,尤其是从黑线姬鼠和白腹巨鼠的胎鼠分离到莱姆鼠病螺旋体,证实莱姆病螺旋体可通过胎盘垂直传播,这对莱姆病自然疫源地的维持和扩大有重要意义.野鼠的感染率在41.18%～86.05%间.血清学和病原学调查结果证实黑线姬鼠和棕背()是中国莱姆病螺旋体的重要储存宿主.
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黑龙江口岸新发蜱传疾病的调查
目的 调查黑龙江口岸地区蜱携带新发蜱传病原体的情况.方法 针对黑龙江省5个中俄边境口岸,2014年4-6月采集蜱类样本188份,利用PCR方法分别扩增5种新发蜱传病原体的特异性核酸片段,通过基因测序进一步鉴定并分型.结果 共检测出莱姆病螺旋体(Borrelia burgdorferi)阳性样本11例,巴贝西原虫(Babesia)1例,斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia) 101例,巴尔通体(Bartonella)6例,嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)10例,感染率分别为5.85％、0.53％、53.7％、3.72％、5.32％.共发现8种病原体,分别是嘎氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii、巴贝西原虫属(Babesia sp.)、劳氏立克次体(Rickettsia raoultii)、新塔拉塞维奇立克次体(Candidatus Rickettsia tarasevichiae)、黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)、巴尔通体属(Bartonella sp.)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum).结论 黑龙江中俄边境存在新发蜱传疾病多样性的特征,提示应重点关注斑点热群立克次体感染,并开展蜱及蜱传疾病的常态监测.
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天津市蓟县地区莱姆病螺旋体主要生物媒介的调查研究
目的 了解当地莱姆病的主要生物媒介-蜱的种类、带菌状况以及在传播莱姆病中的作用.方法 采用布旗法及动物诱捕法在山林地区采集蜱,对蜱种进行鉴定.并进行病原分离培养和 PCR 检测.结果 共收集到 1 226 只蜱,经鉴定属于硬蜱科中 2 属 2 种:硬蜱属的全沟硬蜱和血蜱属的长角血蜱.其中以长角血蜱为优势种,构成比占 92.58%(1 135/1 226);随机对 300 只长角血蜱进行针对莱姆病螺旋体的 PCR 检测,有 14 只阳性,阳性率为 4.67%.并对其余 926 只蜱进行病原分离培养,未得到莱姆病螺旋体.结论 血蜱可能是天津蓟县地区莱姆病传播的主要生物媒介.
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贵州省莱姆病螺旋体的核糖体基因分型研究
目的对从贵州省农耕区的鼠类动物分离到的21株莱姆病螺旋体菌株进行分子流行病学研究.方法应用聚合酶链反应(PCR)从21株莱姆病螺旋体分离株的全基因组DNA扩出5S～23S rRNA基因间隔区,扩增产物用限制性片段长度多态性分析(RFLP)和核酸序列分析.结果贵州省21株莱姆病螺旋体菌株可分为两个基因型:Borrelia valaisiana(B.valaisiana)20株,Borrelia sp1株.结论贵州省农耕区以B.valaisiana基因型为主,目前B.valaisiana对人的致病性已经得到证实.
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中国莱姆病螺旋体伽氏疏螺旋体PD91鞭毛蛋白的基因克隆和表达
目的对中国莱姆病螺旋体伽氏疏螺旋体基因种参照菌株PD91的鞭毛蛋白编码基因进行克隆表达与基因序列分析.方法设计引物,用聚合酶链反应(PCR)技术获得PD91的鞭毛蛋白编码基因片段,经酶切、连接,插入质粒pET-11d中,构成重组质粒pET11d-fla,转化致大肠埃希菌BL21,提取质粒进行酶切、DNA测序和氨基酸序列分析鉴定,诱导表达,筛选高效表达株,应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(WB)方法,鉴定重组蛋白及其抗原性.结果成功地获得了鞭毛蛋白的编码基因片段和基因重组,重组蛋白在宿主菌BL21中高效表达.WB结果显示重组鞭毛蛋白与PD91的鞭毛蛋白具有相同的抗原性.经测序显示该鞭毛蛋白的基因片段长度为1011 bp,与北美莱姆病螺旋体标准株B31的DNA碱基序列及氨基酸序列比较分析,同源性分别为94.70%、95.85%.结论在国内首次成功地对中国莱姆病螺旋体伽氏疏螺旋体基因种的鞭毛蛋白基因进行了克隆表达,并证实具有良好的抗原性,为莱姆病血清学诊断研究提供了较好的基础.
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中国莱姆病螺旋体PD91重组OspC的鉴定和抗原性检测
目的重组中国莱姆病螺旋体PD91外膜蛋白C(OspC)并在大肠埃希菌中表达,用于早期莱姆病诊断的研究.方法用聚合酶链反应(PCR)扩增出PD91外膜蛋白C基因,定向克隆到表达载体PET-11D,构建重组质粒PET-11D-ospC.用PCR、限制性内切酶分析及序列测定等方法鉴定重组质粒.用Western Blot检测其抗原性.结果 OspC 基因被正确克隆到表达载体PET-11D中.序列测定结果证实与国外已报道的序列存在一定的差异.OspC具有强抗原性.结论该项研究为国内莱姆病的早期特异性诊断的研究奠定了基础.
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首次调查发现山东省存在莱姆病自然疫源地
目的 调查山东省的莱姆病自然疫源地.方法 于1992～1999年,在山东省的山林地区设点,用间接免疫荧光抗体试验进行人群莱姆病感染调查,结合流行病学史、临床表现和实验室检查结果进行莱姆病病例诊断;对主要媒介蜱进行调查,用布旗法采集蜱类,分类鉴定,直接免疫荧光抗体法进行中肠带螺旋体率的调查,用BSK培养基分离病原;宿主动物调查,用鼠笼和鼠夹捕获鼠类,分类,解剖,取肾脏、膀胱等,用BSK培养基分离病原.结果 山东省的山林地区人群中存在莱姆病的感染,平均感染率为6.25%,经个案流行病学调查,结合临床症状和血清学检查结果确诊典型病例19例;该地区的蜱类以长角血蜱为优势种,该蜱中肠携带莱姆病螺旋体率为12.0%,从86组长角血蜱培养物中获得2株莱姆病螺旋体;肾脏带菌率检查46只鼠类,发现6只鼠的肾脏内带有典型的莱姆病螺旋体,带菌率为13.04%.结论 首次调查证实山东省的山林地区存在莱姆病的自然疫源地.
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中华硬蜱TROSPA的发现与鉴定
笔者从我国莱姆病媒介蜱种中华硬蜱中鉴定出莱姆病螺旋体外膜蛋白A受体TROSPA.中华硬蜱幼蜱体内的两个cDNA克隆I.sin-1 (258 bp)和I.sin-2 (462 bp)经序列比对和分析属于TROSPA.其中,I.sin-2的氨基酸序列同肩板硬蜱I.scapularis、篦子硬蜱I.ricinus和全沟硬蜱I.persulcatus的相似度分别为88.2％、88.5％和88.8％,而I.sin-1则分别存在46％、46.1％和45.6％的相似度.中华硬蜱TROSPA的发现为解释了中华硬蜱传播莱姆病的机制以及研究中华硬蜱与病原体的相互关系奠定了基础.
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莱姆病实验动物模型
莱姆病是新近发现的一种由蜱传播的自然疫源性疾病，其病原体是伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu lato)，可引起皮肤、内脏组织、神经、大脑等多系统感染，表现出多种多样的临床症状。该病广布亚、欧、美、非、大洋等五大洲30多个国家，估计年发病例30万人左右，美国疾病控制中心(CDC)1994年报道43个州发病13 000例(Hubbard et al.,1998)，我国20个省、市、自治区已有分布和发病报告，每年有万余病例报道，其危害性日益受到人们的关注(万康林等，1998)，1992年被世界卫生组织(WHO)列入重点防治研究对象。 蜱是传播莱姆病的主要媒介，目前已确定作为媒介的蜱类都是硬蜱属(Ixodes)的成员且大部分归属于蓖子硬蜱(I.ricinus)复合组。这些蜱包括亚欧大陆的蓖子硬蜱和全沟硬蜱(I.persulcatus)、美国东西部的肩板硬蜱(I.scalpularis)和太平洋硬蜱(I.pacificus)等，我国林牧区、自然风景区中危害人畜的蜱类，如全沟硬蜱、中华硬蜱(I.sinensis)、锐跗硬蜱(I.acutitarsus)和粒形硬蜱(I.granulatus)等都已发现有莱姆病螺旋体的自然感染，但目前确定作为莱姆病媒介的只有全沟硬蜱，其余蜱种的媒介地位正在进一步研究之中(许荣满和郭天宇，1998)。 动物模型是研究莱姆病实验传播、病理、生理以及治疗方案的重要工具。其病原体伯氏疏螺旋体具有广泛的自然宿主，包括猴(Macaca mulatta)、犬(Cannis familiaris)、兔(Lepus spp.)、豚鼠(Cavia porcellus)、长爪沙鼠(Meriones unguiculatus)、仓鼠(Mesocricetus auratus)、大家鼠(Rattus norvegicus)以及海鸟、灰山雀、孔雀、鸡等，也可以感染许多种实验动物，如金黄色地鼠、小白鼠等。所以，它们都曾被作为莱姆病动物模型在研究中加以应用。由于不同类型的动物模型具备各自不同的特点，故对各种实验动物感染特点的比较筛选，是建立理想的动物模型、进行莱姆病研究的关键。
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我国部分地区蜱中莱姆病螺旋体的检测与基因分型研究
目的对我国部分地区的多种蜱类进行莱姆病螺旋体的检测和基因分型. 方法选择我国黑龙江、吉林和浙江省部分林区为调查点,采集当地蜱类,用巢式PCR法进行检测,阳性产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析和单链构象多态性(SSCP)分析,确定莱姆病螺旋体的基因型. 结果共检测蜱512只,阳性126只,阳性率24.61%.其中吉林全沟硬蜱带菌率为37.00%,黑龙江全沟硬蜱带菌率为20.87%,浙江长角血蜱带菌率为28.07%.RFLP分析表明,蜱中莱姆病螺旋体包括B. garinii和B. afzelii两种基因型.SSCP分析显示为7种亚型,其中B. garinii分为5个亚型,B. afzelii分为2个亚型.发现有3只蜱同时感染不同基因(亚)型莱姆病螺旋体. 结论证实B. garinii和B. afzelii基因型为我国莱姆病螺旋体的优势基因型,并在我国蜱中发现莱姆病螺旋体不同基因(亚)型的混合感染.
关键词： 莱姆病螺旋体 基因型 限制性片段长度多态性 单链构象多态性 蜱 -
伯氏疏螺旋体外膜蛋白OspA胶体金免疫层析法快速检测技术的建立
目的 建立一种快速诊断莱姆病螺旋体的胶体金免疫层析试纸条检测方法.方法 以莱姆病伯氏疏螺旋体标准株B31 DNA为模板,PCR扩增OspA基因,构建重组质粒pET-30a-OspA,以IPTG诱导原核表达并用亲和层析方法对重组蛋白OspA进行纯化;用柠檬酸钠还原法以OspA作为检测线,优化试纸条制备条件,制备莱姆病诊断试纸条,检测其特异性和敏感性;用该方法对20份绵羊血清进行检测,并用WB验证结果的准确性.结果 构建了外膜基因OspA的原核表达体系,获得高纯度的OspA蛋白;用40 nm金颗粒制备的莱姆病胶体金试纸条,适胶体金标记pH值为6.2,SPA蛋白的佳标记量是6μg/ml,该蛋白不与布鲁氏菌、大肠杆菌等阳性血清反应,能重复多次与莱姆病阳性血清特异性反应.用该方法检测20份动物血清样品2份阳性(10％),与WB结果一致.结论 以纯化的OspA蛋白为包被抗原制备的免疫层析试纸条特异性强,敏感性高,与WB验证结果符合率高,且具有准确、快速、方便的优点,可用于临床样品的检测.
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广东梅州市莱姆病自然疫源地调查
目的 了解广东梅州市大埔、平远和梅县莱姆病人群血清流行病学、动物宿主和传播媒介特征. 方法 应用间接免疫荧光试验(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行人群和宿主动物的血清学检测、个案调查、动物宿主和传播媒介病原学调查. 结果 检测人群血清2 184份,莱姆病感染率为10.30%(225/2184),其中林区为10.33%(123/1191),非林区为10.27%(102/993),差异无统计学意义(χ2=0.21,P>0.5);检测牛和野鼠血清各30份,感染率分别为23.33%和43.33%;从褐家鼠和白腹巨鼠各分离到1株莱姆病螺旋体;调查蜱506只,其中台湾角血蜱493只,占97.43%,该蜱中肠带莱姆病螺旋体率为16.00%(8/50),且分离到1株莱姆病螺旋体. 结论 梅州市存在莱姆病自然疫源地,人群普遍易感,野鼠和牛是该地莱姆病螺旋体的主要动物宿主,台湾角血蜱是主要传播媒介.
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从粤东丰溪自然保护区白腹巨鼠和褐家鼠体内分离出莱姆病螺旋体
目的:探讨鼠类携带莱姆病螺旋体情况.方法:用BSK培养基分离病原、单克隆抗体鉴定.结果:从白腹巨鼠和褐家鼠体内分离出2株疏螺旋体,经用莱姆病螺旋体种属特异的单克隆抗体进行间接免疫荧光抗体试验,证实均为莱姆病螺旋体,命名为MD21和MD55.结论:首次从病原学证实鼠类为粤东地区莱姆病螺旋体的主要宿主动物.
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山东省莱姆病地理流行病学研究
目的 调查山东省莱姆病地理分布、媒介生物、动物宿主及病原分离情况,为今后防治提供依据.方法 采用间接免疫荧光抗体试验(IFA)对6个调查点的人群进行莱姆病抗体检测;用直接免疫荧光抗体试验(DFA)检查优势蜱种及其携带莱姆病螺旋体情况,并用BSKⅡ培养基分离培养莱姆病螺旋体.宿主调查采用DFA检查鼠肾.用单克隆抗体和IFA进行菌株的鉴定.结果 共检测血清1934份,阳性121份,感染率6.26%;鲁东、鲁南、鲁中、鲁西北感染率分别为5.76%、7.03%、0、9.81%;各年龄组差异无统计学意义(P＞0.05);男性感染率为5.56%,女性为6.98%,两者间差异无统计学意义(χ2=1.67,P＞0.05);山东省蜱类的优势种为长角血蜱,该蜱中肠带螺旋体率为12.00%;宿主动物调查显示,鼠类带莱姆病螺旋体率为13.26%,黑线姬鼠为优势种(占45.65%),带菌率高为14.24%.从86组培养物中分离到2株莱姆病螺旋体(TSH1、TSH2).结论 不同地区生态环境和传播媒介分布不同,各地区间莱姆病感染程度差别很大.长角血蜱可能为山东省莱姆病的重要生物媒介.
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新疆人群感染莱姆病螺旋体分子流行病学调查
目的 探讨新疆部分自然疫源地自然人群感染莱姆病螺旋体的自然进程及感染莱姆病螺旋体的基因型情况.方法 在2002年夏季完成的1406人莱姆病螺旋体感染血清流行病学调查的基础上,2006年在上述1406人中的1390人阴性人群中,随机抽取119人,与2002年16例阳性(共计135人)为研究对象,在这两个时点收集的血清标本均应用蛋白印迹(Western blot,WB)方法检测抗Borrelia burgdorferi抗体IgM和IgG,并完成莱姆病表现频率调查问卷.同时留取135份尿液标本,应用巢式PCR扩增尿液标本中莱姆病螺旋体5S～23S rRNA间隔区片段,对部分阳性产物测序分析,确定莱姆病螺旋体的基因型,并将PCR检测结果与血清学的检测结果相比较.结果 2002年1406份血清标本中,抗体阳性16份,阴性1390份,阳性率为1.14％(16/1406)(16例中IgM阳性12例,IgG阳性2例,IgM、IgG均阳性者2例).2006年上述16例抗体阳性的感染者中,有7例抗体转为阴性,阴转率为43.75％(7/16),4例由IgM阳性转为IgG阳性,IgM持续阳性5例,2002年抗体阴性的119人中,2006年有58例抗体转为阳性(IgM阳性14例,IgG阳性25例,IgM和IgG均阳性的19例),阳转率为48.74％(58/119),确诊为莱姆病2例.2006年抗B.burgdorferi抗体总阳性率为49.63％(67/135)(2006年阳性58例+2002年阳性9例).无症状IgG血清转换率为34.07％ (46/135)(2002年IgM阳性转换为IgG阳性的4例+2006年IgG阳性的25例、IgM和IgG均阳性的19例,其中确诊莱姆病2例)；3例发展为莱姆病(2.22％).135份尿液PCR检测,阳性22份,阳性率为16.30％ (22/135).8份PCR阳性结果测序分析显示7份为B.garinii,1份为B.afzelii基因型.结论 新疆自然疫源地人群莱姆病螺旋体感染大多为隐性感染,自然进程较为良性,临床莱姆病少有发生.新疆人群莱姆病螺旋体感染基因型主要为B.garinii,其次是B.afzelii.
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从粤东丰溪自然保护区台湾角血蜱体内分离出莱姆病螺旋体
目的:检测台湾角血蜱携带莱姆病螺旋体情况.方法:直接荧光抗体法(DFA)和病原分离培养.结果:该蜱是粤东丰溪自然保护区优势蜱种,用采集的该蜱50只取中肠涂片,DFA检测8只为阳性,阳性率16%;从115只(23组)该蜱中分离出1株莱姆病螺旋体,命名为MD6.经单克隆抗体鉴定,结果与国内M7菌种反应相同.结论:从媒介蜱类分离出莱姆病螺旋体,在广东尚属首次,证实该地为莱姆病流行区.
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青海省部分林区莱姆病流行病学调查
目的 了解青海省莱姆病流行状况和疫源地分布,系统收集莱姆病主要传播媒介(蜱)及其主要宿主动物(鼠)的带菌情况,掌握人群莱姆病的感染水平,为进一步开展莱姆病监测和有效防治莱姆病提供依据.方法 莱姆病螺旋体检测,采用聚合酶链反应;血清抗体(IgG)检测采用间接免疫荧光法.结果 共调查1108人,阳性167例,平均感染率为15.07%;其中牧业区林场人群莱姆病平均感染率7.98%,农业区林场人群为21.21%,显示地区间差异有统计学意义(X2=36.68,P＜0.001);不同性别、年龄人群莱姆病感染率差异不明显;主要传播媒介为青海血蜱,带菌率为23.93%;主要宿主动物以小家鼠为优势种,占46.08%,鼠的总带菌率为20.59%.结论 调查地区不仅有莱姆病感染存在,而且人群感染率还较高,平均感染率高于全国水平.不同地区由于生态环境、生产方式和生活习惯的差异,两地感染程度差别很大,农业区林场人群莱姆病平均感染率明显高于牧业区;青海血蜱为青海省主要传播媒介,可能存在莱姆病自然疫源地.
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湖南省平江县莱姆病调查研究
目的:调查湖南省平江县莱姆病的分布情况.方法:采用间接免疫荧光抗体法和直接荧光抗体染色法,于1999～2000年在平江县选点调查.结果:共查山林地区居民500人,血清抗莱姆病螺旋体抗体(IgG)阳性者32人,阳性率6.40%.38例临床和血清学确诊的莱姆病患者,其主要的临床表现有环形或慢性游走性红斑、关节炎、面神经麻痹、多发性神经炎、脑膜炎和心脏损害等.当地的蜱类以二棘血蜱为优势种,占85%,该蜱中肠携带莱姆病螺旋体率为12.0%(6/50).结论:平江县存在莱姆病的自然疫源地,人群中有莱姆病的发生和流行.
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广东首次分离到莱姆病螺旋体
目的:分离莱姆病螺旋体.方法:鼠、蜱标本接种BSK培养基,分离病原体与单克隆抗体进行间接免疫荧光试验.结果:用BSK培养基分离49只野鼠和250匹蜱,从1只白腹巨鼠胚胎分离到1株螺旋体(LPR30).结论:鉴定为莱姆病螺旋体.
