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C群脑膜炎奈瑟菌部分蛋白表型特征分析
目的 以蛋白质组学研究为基础,分析2003～2005年间我国流脑暴发流行期间C群脑膜炎奈瑟菌菌株分布特征.方法 利用双向电泳技术获得66株2003～2005年流脑流行期内分离的C群脑膜炎奈瑟菌菌株及2株参考菌株的2-DE电泳图谱,并结合质谱分析的结果进行部分外膜蛋白和sucD蛋白表型分析.结果 根据外膜蛋白和sucD蛋白将实验菌株共分为9型,其中安徽菌株分型结果显示出了高度的一致性,而其他地区菌株分型分布则显示出高度的多态性.结论 安徽已经有优势菌型形成,但优势菌型还没在全国范围内出现,此类菌型分布和变迁的检测可能对认识流脑的流行规律和有效进行流脑疾病控制具有重要意义.
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我国某地首株O139霍乱弧菌某些特征的研究
我国某地1996年6月从一名腹泻病人粪便中分离出首例O139霍乱弧菌,并将该菌与国内外菌株形态,生化和遗传学特性进行了比较研究,结果表明此菌株与国内外O139流行菌株具有相似的表型特性(Phenotype),形态,生化特性与O1群相似,但对弧菌抑制剂(O/129)不敏感,不被O1多价血清凝集;用已知的几种霍乱弧菌毒素基因探针与被测O139菌株DNA杂交,结果显示都具有ctx,zot,ace基因;PCR检测ctxA基因与O1群霍乱流行株具有相同的扩增产物;SDS-PAGE分析外膜蛋白所有O139菌株图谱相似;用16SrRNA基因探针与Bgl Ⅰ酶切的染色体DNA杂交,结果表明此菌株与中国及国外菌株分属于不同的核糖体基因型(Ribotype,RT),而且与当年的O1群流行菌株具有相似的RT型,推测该菌株可能是O1群的突变株,对新毒株O139的出现应引起我们高度重视.
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杭州市淋病奈瑟菌血清学分型研究
淋病奈瑟菌的血清型与其耐药性、血清抗性、营养分型、对免疫球蛋白A1蛋白酶的表达以及引起的淋病奈瑟菌感染类型均有密切关系.但淋病奈瑟菌的抗原结构非常复杂,与细菌表层结构有关的外膜蛋白、脂多糖和菌毛都可以作为血清学分类的基础.
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一株产IMP-1型金属β-内酰胺酶并缺失外膜蛋白OprD2铜绿假单胞菌的检出
产金属β-内酰胺酶(metal-β-lactamases,金属酶)和缺失外膜蛋白OprD2是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因.我们从一例严重肺部感染患者痰标本中分离出一株产IMP-1型金属酶并缺失外膜蛋白OprD2的铜绿假单胞菌.
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霍乱弧菌噬菌体VP4受体成分的分析
侵袭细菌的噬菌体可以被该菌株的细胞壁提取物所抑制,既细菌的提取物与噬菌体颗粒混合培育后,如果噬菌体与有受体活性的细菌提取物发生不可逆作用,就不能再感染细菌.本项研究选育鞭毛发育良好的霍乱弧菌菌株,利用有鞭毛的细菌在含有0.1%石炭酸琼脂培养基上培养可以失去鞭毛的特性,选育鞭毛发育不良的菌株.提取上述两种菌株的脂多糖和外膜蛋白,并分别与噬菌体VP4钝化作用.通过噬斑计数测定,比较钝化作用的差异,分析VP4的受体成分.
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应用纯化重组外膜脂蛋白LipL32检测钩端螺旋体病抗体
目的 建立以纯化重组外膜脂蛋白LipL32为基础的钩端螺旋体(钩体)病抗体的检测方法 .方法 以摹因重组技术获取重组钩体外膜脂蛋白LipL32,以该蛋白为抗原,分别使用间接法和夹心法ELISA应用于不同人和鼠血清的检测,检测结果 与钩体显微镜凝集试验(MAT)进行比较,同时人血清的检测结果 还与进口试剂盒比较.结果 纯化的重组蛋白检测9例钩体确诊病例双份血清标本,三种ELISA法的检出率与MAT无明显差别.检测45份MAT阳性标本,间接法ELISA敏感性为71.11%(32/45),夹心法ELISA为80.00%(36/45),而进口 ELISA阳性13份,占28.89%(13/45),25份可疑占55.56%(25/45).特异性检测,MAT阴性血清69份,间接和夹心法ELISA特异度均为97.10%(67/69),其中检测门诊体检血清43份,间接和夹心法ELISA均为阴性,进口ELISA检测14份,也为阴性.检测非钩体发热病例血清标本16份,间接和夹心法ELISA共检出2份阳性,进口ELISA则是1份阳性,12份可疑.检测梅毒螺旋体质控阳性血清10份,四种方法 均为阴性.重组蛋白检测鼠血清标本274份,夹心法ELISA的敏感性为86.75%(131/151),特异性为99.19%(122/123),符合率为92.34%(253/274),与MAT检测结果 相符.结论 重组LipL32蛋白具有结合活性,可应用于钩体血清抗体的检测,其中夹心法ELISA对鼠血清钩体抗体的检测显示较好的敏感性和特异性,适用于钩体病现场血清流行病学大样本调查.
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钩端螺旋体主要属特异性蛋白抗原分布及其免疫性研究
目的 确定致病性问号钩端螺旋体(钩体)属特异性外膜蛋白的抗原性和交叉免疫反应性,为研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒提供依据.方法 采用Ni-NTA亲和层析法,提取了4种钩体外膜蛋白主要基因型重组表达产物rLipL21、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2,并用SDS-PAGE检测表达及提纯效果.上述重组蛋白常规皮下免疫家兔获得抗血清,显微镜凝集试验(MAT)检测各抗血清交叉凝集效价.采用盐变法提取了我国15群问号钩体参考标准株及非致病的双曲钩体Patoc Ⅰ株的外膜蛋白.以兔抗血清为一抗,采用Western blot检测上述4种外膜蛋白自然表达情况及其免疫反应性.结果 rLipL21、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2表达量分别约占细菌总蛋白的10%、40%和35%、15%和10%、30%和15%,各重组蛋白SDS-PAGE提纯后均仅见单一的蛋白条带.重组蛋白兔抗血清在同一基因不同基因型表达产物之间有广泛的交叉免疫反应性,与不同钩体血清群的MAT效价为1:2～1:128.各血清群钩体外膜中均可检出上述4种外膜蛋白,但LipL21仅存在于问号钩体中.结论 LipL21、LipL32、LipL41、OmpL1均为钩体属特异性表面抗原,可作为通用性钩体疫苗及检测试剂盒的候选抗原.
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五日热巴通体重组外膜蛋白HbpA的研制和抗原性分析
为克隆并表达五日热巴通体外膜蛋白HbpA的基因,并对其抗原性进行初步分析,采用PCR方法从五日热巴通体基因组DNA扩增hbpA基因,将目的基因片段插入原核表达质粒pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-hbpA;将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导目的基因表达,以SDS-PAGE电泳以及免疫印迹实验分析表达的目的蛋白.SDS-PAGE电泳分析发现pET32a(+)-hbpA转化菌高效表达一48 kDa重组蛋白;免疫印迹分析发现该蛋白与其免疫血清发生强烈反应;间接免疫荧光分析发现该重组蛋白免疫血清能特异识别五日热巴通体.实验结果表明五日热巴通体外膜蛋白HhpA的基因已在大肠杆菌中高效表达.
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恙虫病东方体58kDa热休克蛋白与47kDa外膜蛋白的基因嵌合及58-47嵌合基因在大肠杆菌中的表达
采用PCR方法,从恙虫病东方体Karp株基因组DNA中扩增58kDa热休克蛋白的基因,将该基因分别与原核表达载体pQE30及47kDa外膜蛋白的基因重组质粒(pQE30/47)连接,构建pQE30/58及pQF30/58-47重组质粒,用重组质粒转化大肠杆菌.SDS-PAGE显示,pQE30/58和pQE30/58-47转化的大肠杆菌分别产生-58kDa重组蛋白和一90kDa的双抗原(58-47)融合蛋白.免疫印迹分析显示Karp株免疫血清能特异识别58kDa重组蛋白和90kDa融合蛋白,90kDa融合蛋白既与47kDa重组蛋白也与58kDa重组蛋白的免疫血清特异反应,58kDa与47kDa重组蛋白也被90kDa融合蛋白免疫血清所识别.研究结果证明58-47融合蛋白具有恙虫病东方体Karp株47kDa外膜蛋白和58kDa热休克蛋白的抗原特性.
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黑龙江立克次体外膜蛋白B基因表达及表达重组蛋白的抗原性分析
黑龙江立克次体为远东蜱传斑点热病原体,本文以黑龙江立克次体基因组为模板,扩增ompB的4段基因,利用原核表达载体构建重组表达质粒,IPTG诱导重组质粒转化的大肠杆菌表达重组目的蛋白,并对其抗原性进行分析.免疫印迹反应表明,重组表达的4个蛋白均与黑龙江立克次体感染小鼠血清反应.该4个重组蛋白分别免疫小鼠后,分析其血清的特异性结果显示,4个重组蛋白免疫血清,其特异性抗体效价均≥1:5 120,与斑点热群立氏立克次体有相对明显的血清学交叉反应(≥1:40),而和斑疹伤寒群立克次体仅有轻度交叉反应(≤1:40).结果表明,重组OmpB蛋白能有效诱导机体产生特异性体液免疫应答,并能与黑龙江立克次体抗体产生特异反应,显示其具有良好的抗原性.
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恙虫病东方体三种膜蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析
用恙虫病东方体的r47、 r56、 r58 kDa重组膜蛋白抗原包被建立酶联免疫吸附试验（ ELISA ），对恙虫病东方体实验感染小鼠血清和临床患者血清做IgG抗体检测。8份恙虫病感染小鼠血清中除1份血清与r58 kDa蛋白的反应阴性外其他反应均为阳性；而这3个重组蛋白与贝氏柯克斯体（ Q热病原体）、莫氏立克次体（地方性斑疹伤寒病原体）、黑龙江立克次体（远东斑点热病原体）感染小鼠血清反应均为阴性。另外，12份恙虫病患者血清对这3个蛋白的反应均有11份（92％）为阳性。另外， r47 kDa抗原对11份Q热患者血清、11份斑疹伤寒患者血清、13份斑点热患者血清的反应阳性率分别有27％、18％、23％，对r56 kDa抗原分别为27％、0％、8％，对r58 kDa抗原分别为18％、18％、23％。这些结果显示这3个重组蛋白抗原均有识别恙虫病东方体感染血清的良好特异性和敏感性，用这3种重组蛋白抗原建立的ELISA将为我国恙虫病血清学诊断提供新的实用方法。
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中华硬蜱TROSPA的发现与鉴定
笔者从我国莱姆病媒介蜱种中华硬蜱中鉴定出莱姆病螺旋体外膜蛋白A受体TROSPA.中华硬蜱幼蜱体内的两个cDNA克隆I.sin-1 (258 bp)和I.sin-2 (462 bp)经序列比对和分析属于TROSPA.其中,I.sin-2的氨基酸序列同肩板硬蜱I.scapularis、篦子硬蜱I.ricinus和全沟硬蜱I.persulcatus的相似度分别为88.2％、88.5％和88.8％,而I.sin-1则分别存在46％、46.1％和45.6％的相似度.中华硬蜱TROSPA的发现为解释了中华硬蜱传播莱姆病的机制以及研究中华硬蜱与病原体的相互关系奠定了基础.
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铜绿假单胞菌外膜蛋白F疫苗的研究进展
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是广泛存在于自然界中的革兰阴性(G-)杆菌，代谢的多样性决定其能在不同的环境中生存，包括土壤、水生环境、植物以及动物组织中。
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KPC-2基因和外膜蛋白介导的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药机制分析
目的 研究临床分离耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制. 方法 收集徐州医学院附属医院2013年2-12月临床分离的非重复碳青霉烯类抗菌药物耐药肺炎克雷伯菌株47株并进行鉴定.药敏试验采用琼脂稀释法,采用改良Hodge方法检测碳青霉烯酶,采用EDTA-Na2双纸片协同法检测金属β-内酰胺酶,采用PCR方法检测KPC-2基因,通过肠杆菌基因间重复性一致性序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)进行KPC基因分型.采用质粒接合试验确定耐药基因的转移性,采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析耐药菌株外膜孔道蛋白的改变情况.结果 47株肺炎克雷伯菌对除多粘菌素和替加环素外的其他抗生素均显示较高的耐药性.改良Hodge试验阳性43株,金属酶检测试验结果均为阴性.ERIC-PCR将44株KPC-2基因阳性肺炎克雷伯菌分为4型.3株分离菌株接合试验获得成功,3株肺炎克雷伯菌外膜孔道蛋白Ompk36的缺失. 结论 本院分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌对临床常用抗生素显示较高水平的耐药性,其耐药机制主要是产碳青霉稀酶KPC-2.部分分离菌株存在耐药质粒的水平传播.另外,外膜孔道蛋白的缺失也是导致细菌对碳青霉烯类抗菌药物敏感度降低的重要原因.
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我国鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类药物机制的Meta分析
目的 了解我国鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的相关耐药机制. 方法 采用Meta分析方法,分析我国15个省(市)2 354株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌耐药物机制,主要是产生碳青霉烯酶、外膜蛋白缺失和Ade ABC外排系统3种. 结果 在淮河以北地区鲍曼不动杆菌耐药基因OXA-51、Int1、OXA-23、OXA-58、IMP及VIM检出率分别为99.4％、97.2％、77.0％、1.6％、1.1 ％和0.8％,淮河以南地区分别为91.7％、62.8％、78.8％、2.4％、3.5％和1.0％；SIM和OXA-24基因在我国尚无检出报道.外膜蛋白缺失率达91.7％,Ade ABC外排系统检出率为55.4％. 结论 我国鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类药物机制以外膜蛋白缺失和存在OXA-51、OXA-23基因及Ade ABC外排系统为主,金属酶基因IMP及VIM检出率均很低,SIM和OXA-24基因尚未检出.
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青藏铁路沿线鼠疫菌外膜蛋白种类的研究
目的 研究并分析青藏铁路沿线鼠疫菌外膜蛋白种类及相对分子质量.方法 鼠疫菌经破碎后采取超高速离心法提取外膜蛋白,利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)系统分离鼠疫菌外膜蛋白.结果 在10%的SDS-PAGE上,37℃条件下的培养物可表达26条外膜蛋白带,28℃培养物可表达36条外膜蛋白.结论 试验用鼠疫菌株可分泌标准的外膜蛋白,属YOP1型.
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耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌耐药机制及1型整合酶基因的研究
铜绿假单胞菌(PAE)是医院感染的重要病原菌之一,探讨本地区临床分离的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌耐药性及金属β内酰胺酶、外膜蛋白通道OprD2基因和1型整合酶基因存在状况有实用意义.用PCR法对金属β内酰胺酶IMP、VIM、SPM、GIM基因和外膜蛋白通道OprD2基因及1型整合酶基因等6种耐药基因进行检测与研究,并用K-B纸片扩散法和微量稀释法测定对庆大霉素等18种抗菌药物的敏感性.
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尿道致病性大肠杆菌新基因R049特征的研究
目的 明确从国内分离的尿道致病性大肠杆菌(UPEC) 132中发现的新基因R049的特征及其表达蛋白在菌体内的定位。方法 提取UPEC132染色体DNA，鸟枪法构建文库，高通量焦磷酸法测序，Newbler软件拼接，进行生物信息学分析，确定R049相关片段的特征。提取UPEC132的内膜和外膜蛋白，与其全菌裂解物一起进行SDS-PAGE，用R049重组蛋白抗血清进行Western blot，确定R049表达蛋白的菌体内位置。结果 成功构建UPEC 132染色体文库，获取R049-contig169022 bp，与UPEC536染色体第233074至451502位碱基序列同源性较高，其中含有R049基因的20773 bp片段替代相当于UPEC536染色体上PAIⅢ536的位置，G+C含量为46.97％，两端具有正向重复序列，并与插入元件整合酶基因和thrW tRNA基因相邻，包含25个ORF，命名为R049 -GI。R049基因位于R049-GI的第13个ORF。SDS-PAGE和Western blot分析显示R049基因表达相对分子质量为47.0× 103蛋白是UPEC132的外膜蛋白。结论 R049基因编码细菌的外膜蛋白，是UPEC132通过基因水平转移获得的染色体基因组岛的组成部分。
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我国主要问号钩端螺旋体血清群lipL21基因序列及其产物免疫反应性分析
目的 分析我国15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株外膜脂蛋白lipL21基因序列,构建该基因原核表达系统并鉴定表达产物的免疫原性,了解lipL21基因自然表达状况.方法 高保真PCR扩增上述问号钩体株及双曲钩体Patoc型PatocⅠ株基因组DNA中全长lipL21基因片段,T-A克隆后测序并构建其原核表达系统.分别用钩体TR/PatocⅠ和rLipL21兔抗血清为一抗的Western blot鉴定目的重组蛋白rLipL21的免疫原性,显微镜凝集试验(MAT)检测rLipL21兔抗血清的交叉凝集效价.以盐变-去垢剂处理法提取钩体外膜蛋白,用SDS-PAGE和免疫印迹法检测上述钩体株lipL21基因自然表达情况.结果 上述钩体株均存在序列高度保守的lipL21基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.75%～99.82%和99.46%～100%.rLipL21能与TR/PatocⅠ及rLipL21兔抗血清发生结合反应.rLipL21免疫家兔能产生抗体,该抗体对上述15株问号钩体MAT效价为1:16～1:128.问号钩体外膜标本中均可检出LipL21,双曲钩体则否.结论 我国钩体群参考标准株均含有序列保守的lipL21基因并自然表达于外膜,双曲钩体PatocⅠ株虽含有lipL21基因但未表达.rLipL21具有良好的抗原性和免疫反应性,有可能作为新型钩体疫苗或检测试剂盒的候选属特异性表面抗原之一.
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铜绿假单胞菌B细胞表位-MyD88表达质粒的构建及其相关研究
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)外膜蛋白F(OprF)的主动免疫能诱发机体产生特异性体液免疫应答,发挥局部保护作用.然而OprF的完整蛋白对机体具有潜在的危害性.现有研究表明OprF蛋白含有大量的B细胞表位,因此,应用OprF优势抗原表位设计的疫苗,既能诱导机体产生抗Pa的中和抗体,又能克服非抗原决定簇成分潜在的毒副作用.考虑到表位蛋白的免疫原性较弱,不足以引发良好的免疫应答,故利用新型免疫佐剂MyD88来调节机体.
