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钩端螺旋体主要属特异性蛋白抗原分布及其免疫性研究
目的 确定致病性问号钩端螺旋体(钩体)属特异性外膜蛋白的抗原性和交叉免疫反应性,为研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒提供依据.方法 采用Ni-NTA亲和层析法,提取了4种钩体外膜蛋白主要基因型重组表达产物rLipL21、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2,并用SDS-PAGE检测表达及提纯效果.上述重组蛋白常规皮下免疫家兔获得抗血清,显微镜凝集试验(MAT)检测各抗血清交叉凝集效价.采用盐变法提取了我国15群问号钩体参考标准株及非致病的双曲钩体Patoc Ⅰ株的外膜蛋白.以兔抗血清为一抗,采用Western blot检测上述4种外膜蛋白自然表达情况及其免疫反应性.结果 rLipL21、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2表达量分别约占细菌总蛋白的10%、40%和35%、15%和10%、30%和15%,各重组蛋白SDS-PAGE提纯后均仅见单一的蛋白条带.重组蛋白兔抗血清在同一基因不同基因型表达产物之间有广泛的交叉免疫反应性,与不同钩体血清群的MAT效价为1:2～1:128.各血清群钩体外膜中均可检出上述4种外膜蛋白,但LipL21仅存在于问号钩体中.结论 LipL21、LipL32、LipL41、OmpL1均为钩体属特异性表面抗原,可作为通用性钩体疫苗及检测试剂盒的候选抗原.
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问号钩端螺旋体T和B细胞表位联合基因的原核表达及其产物免疫性分析
目的 构建问号钩端螺旋体(简称钩体)LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T-和B-细胞联合表位融合基因及其原核表达系统,并对表达产物的免疫原性进行鉴定.方法 人工合成多表位联合基因并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测重组蛋白；采用MAT检测重组蛋白兔抗血清与我国钩体标准参考株的凝集效价；Western blot和ELISA检测重组蛋白的免疫原性.结果 获得了多表位融合基因并构建了原核表达系统.表达产物的相对分子质量约为23×103,且主要以可溶性形式存在；重组蛋白兔抗血清免疫双扩散效价为1∶8,该抗血清能与我国15群的钩体标准参考株发生凝集反应,ELISA证明该重组蛋白能检测不同群型钩体感染患者血清中的抗钩体抗体.结论 成功构建了包含钩体LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T和B细胞联合表位基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及血清学检测的抗原.
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问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因原核表达及其产物免疫原性分析
目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定.方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因,并用常规基因工程方法建立其原核表达系统.采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统,检测目的重组蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达量.采用免疫双扩散试验及Western Blot,鉴定rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2的免疫原性.结果:获得了序列正确的lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统E.coli BL21DE-3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2.表达条件优化后的rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2产量为37.78 mg/L,是优化前的3.7倍.rLipL32/1-LipL21- OmpL1/2兔抗血清免疫双扩效价为1∶4.rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2抗血清能识别rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2以及rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2.rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2能与问号钩体56601株全菌兔抗血清以及黄疸出血群、流感伤寒群、波摩那群、秋季群问号钩体感染患者血清出现阳性杂交信号.结论:成功地构建了lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及通用型钩体病血清学检测的抗原.
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基于问号钩端螺旋体rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2融合抗原的ELISAs建立及应用
目的:建立基于问号钩端螺旋体(简称钩体)rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2融合抗原的ELISAs,并应用于检测钩体病患者血清特异性IgG和IgM.方法:采用显微镜凝集试验(MAT),检测钩体病患者血清及rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清对我国问号钩体参考标准株的效价.分别以rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2、rLipL32/1、rLipL21和rOmpL1/2为包被抗原,建立检测血清特异性IgM和IgG的ELISAs,并用于检测107份MAT阳性钩体病患者血清标本.结果:MAT结果证实,66%(71/107)患者感染黄疸出血群问号钩体,rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清对我国15株问号钩体参考标准株的凝集效价为1∶20～1∶160.rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2、rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2抗原用于检测IgM的ELISA阳性率分别为89.7%、75.7%、85.1%和79.4%,用于检测IgG的ELISA阳性率分别为99.1%、99.1%、94.4%和86.0%.rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2-IgM-ELISA检测阳性率高于其它3种检测IgM的ELISAs(P<0.05),rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2-IgG-ELISA检测阳性率高于rOmpL1/2-IgG-ELISA(P<0.05),但与rLipL21-IgG-ELISA及rLipL32/1-IgG-ELISA接近(P>0.05).结论:rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2-ELISAs可作为敏感、特异的通用型钩体病血清学早期诊断方法.
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结核分枝杆菌诊断抗原的性质和应用
结核分枝杆菌(MTB)能增强HIV-1病毒在体内的繁殖,因此,结核病流行国家艾滋病患者感染情况更加严重[1],1995年美国科学家报道了对MTB的保护性免疫反应的研究,1997年世界卫生组织把发现种属特异性抗原作为结核分枝杆菌的研究重点.自酶联免疫法(ELISA)应用临床以来,血清学检测结核病人特异性抗体和抗原已成为结核病诊断的辅助方法.
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不同毒力钩端螺旋体属特异性外膜蛋白抗原的分析
目的了解不同毒力钩端螺旋体株有无属特异性外膜蛋白抗原.方法 TR/patoc Ⅰ钩体属特异性抗原免疫家兔获得抗血清,以显微镜凝集试验检测TR/patoc Ⅰ属特异性抗原抗血清对我国15群17型问号钩体和2群2型双曲钩体的凝集情况.采用Auran介绍的方法制备问号钩体黄疸出血群赖型56601株、波摩那群波摩那型56608株和双曲钩体三宝垄群Patoc型patocⅠ株的外膜蛋白,用SDS-PAGE及Western blot分析不同毒力钩体外膜蛋白的电泳特征及与TR/patoc Ⅰ属特异性抗血清的反应性.结果钩体TR/patoc I属特异性抗血清能与上述各株钩体发生凝集反应,其效价为1∶256～1∶512.三种不同毒力钩体外膜蛋白有相似的SDS-PAGE图谱,其主要蛋白组分的分子量约为60kDa,Western blot结果证实在约31kDa处有一共同的能与TR/patoc I属特异性抗血清发生反应的阳性条带.结论钩体细胞表面具有属特异性抗原,分子量31KDa外膜蛋白可能是属特异性抗原之一.
